Een Geà ¯ soleerde semi-intacte Voorbereiding van de muis Vestibulaire Sensory epitheel voor elektrofysiologie en hoge-resolutie twee-foton microscopie
Summary
Analyse van vestibulaire haar celfunctie wordt bemoeilijkt door hun locatie diep in het moeilijkste deel van de schedel, de petrous temporale bot. Meest functionele haarcellen studies hebben acuut gebruikt geïsoleerde haarcellen. Hier beschrijven we een semi-intacte bereiding van muis vestibulaire epitheel voor elektrofysiologische en twee-foton microscopie studies.
Abstract
Inzicht vestibulaire haarcellen functioneren onder normale omstandigheden, of hoe trauma, ziekte en veroudering deze te verstoren is een essentiële stap in de ontwikkeling van preventieve benaderingen en / of nieuwe therapeutische strategieën. Toch hebben de meeste studies kijken naar abnormale vestibulaire functie niet op cellulair niveau geweest, maar vooral gericht op gedrags-assays van vestibulaire disfunctie, zoals gang analyses en vestibulo-oculaire reflex prestaties. Hoewel dit werk heeft waardevolle gegevens over wat er gebeurt als er iets misgaat opgeleverd, is weinig informatie die verkregen wordt met betrekking tot de onderliggende oorzaken van disfunctioneren. Van de studies die zich richten op de cellulaire en subcellulaire processen die vestibulaire functie ten grondslag liggen, de meeste hebben zich op acuut geïsoleerd haarcellen, verstoken van hun synaptische verbindingen en ondersteunende cel milieu. Daarom is een grote technische uitdaging toegang tot de uiterst gevoelig vestibulaire haarcellen geweest in een prepreiding, dat is tenminste verstoord, fysiologisch. Hier laten we zien een semi-intacte voorbereiding van de muis vestibulaire sensorische epitheel dat de lokale micro-omgeving behoudt waaronder haarcel / primaire afferente complexen.
Introduction
Ondanks de belangrijke bijdrage van het evenwichtsorgaan aan ons dagelijks leven, een duidelijk begrip van de processen die verantwoordelijk zijn voor de waargenomen achteruitgang van vestibulaire functie met de leeftijd blijven ongrijpbaar. Een reden voor dit gebrek aan kennis is dat daling van vestibulaire functie is vrijwel uitsluitend werd onderzocht met behulp van gedrags-assays, waaronder de vestibulo-oculaire reflex (VOR), een nauwkeurige indicator van extrinsieke vestibulaire functie, maar biedt beperkte inzicht in de veranderingen van de intrinsieke componenten . Dit is een belangrijke belemmering voor ons begrip van vestibulaire haar cel functie in gezondheid, ziekte of veroudering.
Hoewel er veel studies van individuele vestibulaire haarcellen zijn, is een ernstige tekortkoming is de afhankelijkheid van acute haarcel preparaten die haarcellen en zelfs kelk afferente terminals uit hun normale omgeving worden verwijderd door mechanische en / of enzymatische behandeling. Dergelijke benaderingen onvermijdelijkebly verstoren de delicate microarchitectuur tussen haar cel en kelk, en haar cel en ondersteunende cel. Met de ontwikkeling van semi-intacte preparaten 1-5 en een geïsoleerde muis labyrint bereiding 6, is er nu een mogelijkheid om de verschillende vormen van synaptische communicatie bestuderen onder omstandigheden die sterker lijken op die in vivo. Inderdaad, Lim et al.. (2011) toonde duidelijke verschillen in gehele cellen stromen opgenomen met acuut geïsoleerde type I vestibulaire haarcellen vergelijking met die welke bleven ingebed in de neuroepithelium. Concreet wordt gedacht aan kalium ophopen in de intercellulaire ruimte, tussen de haren cel en kelk afferente en aanzienlijk veranderen haar cel respons 7. Dit soort informatie zou onmogelijk te verkrijgen zonder dat de semi-intacte voorbereiding van de vestibulaire sensorische epitheel hier beschreven zijn. We tonen de semi-intacte voorbereiding van de muis crista 3, En tonen representatieve resultaten van whole-cell patch elektrofysiologie, en twee-foton calcium beeldvorming.
Protocol
Representative Results
Discussion
De mechanismen die ten grondslag liggen aan onze evenwichtsgevoel hebben weinig aandacht gekregen in vergelijking met andere sensorische systemen, zoals de visuele en auditieve systemen. Van de studies die veranderingen in vestibulaire of balans functie hebben onderzocht, de meeste zijn gericht op gedragsmaatregelen waaronder de vestibulo-oculaire reflex, met onvolledige kennis van de fundamentele bouwstenen van de balans-de vestibulaire haarcellen zelf. De studies die hebben zich geconcentreerd op de haarcelle…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Financiering voor dit werk werd geleverd door een Garnett Passe en Rodney Williams Memorial Foundation Project subsidie aan R. Lim en AJ Kamp.
Materials
| REAGENTS | |||
| Leibovitz medium L-15 | Sigma Aldrich | L4386-10X1L | |
| BAPTA-1-oregon green | Invitrogen | O6806 | |
| EQUIPMENT | |||
| Stereo microscope | Leica Microsystems | A60S | |
| Upright microscope | Olympus | BX51WI | |
| Two-photon microscope | Olympus/La Vision | BX51WI/ TriMScope II | |
| Dumont #5 SF Forceps | FST | 11252-00 | |
| Friedman-Pearson Rongeurs | FST | 16221-14 | |
| Standard Pattern Scissors | FST | 14001-12 | |
| InstraTECH A-D converter | HEKA | ITC-18 | |
| Sutter Micromanipulator | Sutter | MP-225/M | |
| multiclamp amplifier | Axon Instruments | 700B | |
| Data acquisition software (electrophysiology) | Axograph | N/A | |
| Imspector Data acquisition software (two-photon) | Max Planck innovation | N/A |
References
- Dulon, D., Safieddine, S., Jones, S. M., Petit, C. Otoferlin is critical for a highly sensitive and linear calcium-dependent exocytosis at vestibular hair cell ribbon synapses. J. Neurosci. 29, 10474-10487 (2009).
- Highstein, S., Art, J., Holstein, G., Rabbitt, R. Simultaneous pre- and post-synaptic recording from the peripheral vestibular calyx and its included type I hair cell. , (2009).
- Kindig, A. E., Lim, R., Callister, R. J., Brichta, A. M. Voltage dependent currents in type I and II hair cell and calyx terminals of primary afferents in an intact in vitro mouse vestibular crista preparation. , (2009).
- Chatlani, S., Goldberg, J. M. Whole-cell recordings from calyx endings in the turtle posterior crista. , (2010).
- Songer, J. E., Eatock, R. A. Transduction in the mammalian saccule. , (2010).
- Lee, H. Y., Camp, A. J., Callister, R. J., Brichta, A. M. Vestibular primary afferent activity in an in vitro preparation of the mouse inner ear. J. Neurosci. Methods. 145, 73-87 (2005).
- Lim, R., Kindig, A. E., Donne, S. W., Callister, R. J., Brichta, A. M. Potassium accumulation between type I hair cells and calyx terminals in mouse crista. Exp. Brain Res. 210, 607-621 (2011).
- Camp, A. J., Callister, R. J., Brichta, A. M. Inhibitory synaptic transmission differs in mouse type A and B medial vestibular nucleus neurons in vitro. J. Neurophysiol. 95, 3208-3218 (2006).
- Camp, A. J., et al. Attenuated glycine receptor function reduces excitability of mouse medial vestibular nucleus neurons. Neuroscience. 170, 348-360 (2010).
- Briggman, K. L., Euler, T. Bulk electroporation and population calcium imaging in the adult mammalian retina. J. Neurophysiol. 105, 2601-2609 (2011).
- Briggman, K. L., Helmstaedter, M., Denk, W. Wiring specificity in the direction-selectivity circuit of the retina. Nature. 471, 183-188 (2011).
- Rennie, K. J., Streeter, M. A. Voltage-dependent currents in isolated vestibular afferent calyx terminals. J. Neurophysiol. 95, 26-32 (2006).
- Hudspeth, A. J., Lewis, R. S. Kinetic analysis of voltage- and ion-dependent conductances in saccular hair cells of the bull-frog, Rana catesbeiana. J. Physiol. 400, 237-274 (1988).
- Rennie, K. J., Ashmore, J. F. Ionic currents in isolated vestibular hair cells from the guinea-pig crista ampullaris. Hear. Res. 51, 279-291 (1991).
