הכנה חצי שלמות מבודדת של האפיתל החושית שיווי משקל העכבר למיקרוסקופיה שני הפוטונים אלקטרופיזיולוגיה והרזולוציה גבוהה
Summary
ניתוח של תפקוד תא שיער שיווי משקל הוא מסובך בשל מיקומם העמוק בתוך החלק הקשה ביותר של הגולגולת, העצם הטמפורלית petrous. רוב מחקרי תא שיער פונקציונליים השתמשו בחריפות תאי שיער מבודד. כאן אנו מתארים הכנה למחצה שלמה של האפיתל שיווי משקל עכבר למחקרי מיקרוסקופיה אלקטרו ושני פוטונים.
Abstract
לתפקד תאי שיער שיווי המשקל הבנה בתנאים רגילים, או איך טראומה, מחלה, הזדקנות ולשבש את הפונקציה הזו היא צעד חיוני בהתפתחות של גישות ו / או אסטרטגיות טיפוליות חדשניות מונעת. עם זאת, הרוב המכריע של מחקרים שמסתכלים על תפקוד שיווי משקל נורמלי לא היה ברמה התאית, אבל התמקד בעיקר במבחני התנהגות של תפקוד שיווי משקל כגון הליכה וניתוח ביצועי רפלקס vestibulo-עיניים. אמנם עבודה זו הניבה נתונים יקרי ערך לגבי מה שקורה כאשר דברים משתבשים, מעט מידע שלקט בנוגע לגורמים הבסיסיים של בעיות בתפקוד. מהמחקרים שיתמקדו בתהליכים התאיים וsubcellular העומדים בבסיס תפקוד שיווי משקל, רוב הסתמכו על החריפות בודדו תאי שיער, נטולי הקשרים סינפטיים ואת סביבת תאי תמיכה. לכן, אתגר טכני גדול כבר גישה לתאי שיער שיווי המשקל הרגישים להפליא בהכנהaration ששבש לפחות, מבחינה פיזיולוגית. כאן אנו מדגימים הכנה למחצה שלמה של האפיתל חושי שיווי משקל העכבר ששומר על מיקרו הסביבה המקומית הכולל תא שיער / מתחמים מביא עיקריים.
Introduction
למרות התרומה המשמעותית של מערכת שיווי המשקל לחיי היומיום שלנו, יש הבנה ברורה של התהליכים האחראים לירידה שנצפתה בתפקוד שיווי משקל עם גיל נשארת חמקמקה. אחת סיבות לחוסר הידע הזה הוא שהירידה בתפקוד שיווי משקל יש באופן בלעדי כמעט נחקרה באמצעות מבחני התנהגות, כוללים רפלקס vestibulo-העיני (VOR), חיווי מדויק של תפקוד שיווי משקל חיצוני, אך מספקת תובנות מוגבלות לשינויים של מרכיבים מהותיים . זהו מכשול עיקרי להבנה שלנו של תפקוד תא שיער שיווי משקל בבריאות, מחלה, או הזדקנות.
אמנם יש כבר מחקרים רבים של תאי שיער שיווי המשקל בודדים, חסרון גדול היה ההסתמכות על הכנות תא שיער חריפות, שבו תאי שיער ומסופים מביא אפילו גביע יוסרו מהסביבה הרגילה שלהם באמצעות טיפול מכאני ו / או האנזימטית. inevita גישות כגוןבליי לשבש את ארכיטקטורה העדינה בין תאי שיער וגביע, ושיער של תא ותא תמיכה. עם התפתחותה של הכנות למחצה ללא פגע 1-5, והכנת מבוך עכבר מבודדת 6, עכשיו יש הזדמנות ללמוד את הצורות השונות של תקשורת הסינפטית בתנאים שנראה דומה יותר לin vivo. ואכן, Lim et al. (2011) הראה הבדלים בולטים בכל זרמים סלולריים נרשמו מסוג החריפות מבודד אני תאי שיער שיווי המשקל בהשוואה לאלה שנשארו מוטבעים בתוך neuroepithelium. באופן ספציפי, הוא חשב אשלגן להצטבר בחלל בין התאית, בין תא השיער וגביע עצבים ולשנות באופן משמעותי תגובת תא שיער 7. מידע מסוג זה יהיה בלתי אפשרי להשגה ללא הכנה למחצה השלמה של האפיתל החושי שיווי המשקל שתואר כאן. אנו מדגימים את ההכנה למחצה השלמה של עכבר Crista 3, ולהראות תוצאות נציג המתקבלות מכל תא התיקון electrophysiology, וסידן הדמיה שני פוטונים.
Protocol
Representative Results
Discussion
מנגנוני תחושת האיזון שלנו זכו לתשומת לב מוגבלת בהשוואה למערכות חושיות אחרות, למשל את מערכות ראייה ושמיעה. מהמחקרים שחקרו שינויים בתפקוד שיווי משקל או איזון, רוב התמקדו באמצעים התנהגותיים כולל את רפלקס vestibulo-העיני, עם ידע לא שלם מאבני הבניין הבסיסיים של מאזן תאי ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מימון עבור עבודה זו סופק על ידי מאטה גארנט ורודני וויליאמס קרן זיכרון לפרויקט מענק לר 'לים ומחנה AJ.
Materials
| REAGENTS | |||
| Leibovitz medium L-15 | Sigma Aldrich | L4386-10X1L | |
| BAPTA-1-oregon green | Invitrogen | O6806 | |
| EQUIPMENT | |||
| Stereo microscope | Leica Microsystems | A60S | |
| Upright microscope | Olympus | BX51WI | |
| Two-photon microscope | Olympus/La Vision | BX51WI/ TriMScope II | |
| Dumont #5 SF Forceps | FST | 11252-00 | |
| Friedman-Pearson Rongeurs | FST | 16221-14 | |
| Standard Pattern Scissors | FST | 14001-12 | |
| InstraTECH A-D converter | HEKA | ITC-18 | |
| Sutter Micromanipulator | Sutter | MP-225/M | |
| multiclamp amplifier | Axon Instruments | 700B | |
| Data acquisition software (electrophysiology) | Axograph | N/A | |
| Imspector Data acquisition software (two-photon) | Max Planck innovation | N/A |
References
- Dulon, D., Safieddine, S., Jones, S. M., Petit, C. Otoferlin is critical for a highly sensitive and linear calcium-dependent exocytosis at vestibular hair cell ribbon synapses. J. Neurosci. 29, 10474-10487 (2009).
- Highstein, S., Art, J., Holstein, G., Rabbitt, R. Simultaneous pre- and post-synaptic recording from the peripheral vestibular calyx and its included type I hair cell. , (2009).
- Kindig, A. E., Lim, R., Callister, R. J., Brichta, A. M. Voltage dependent currents in type I and II hair cell and calyx terminals of primary afferents in an intact in vitro mouse vestibular crista preparation. , (2009).
- Chatlani, S., Goldberg, J. M. Whole-cell recordings from calyx endings in the turtle posterior crista. , (2010).
- Songer, J. E., Eatock, R. A. Transduction in the mammalian saccule. , (2010).
- Lee, H. Y., Camp, A. J., Callister, R. J., Brichta, A. M. Vestibular primary afferent activity in an in vitro preparation of the mouse inner ear. J. Neurosci. Methods. 145, 73-87 (2005).
- Lim, R., Kindig, A. E., Donne, S. W., Callister, R. J., Brichta, A. M. Potassium accumulation between type I hair cells and calyx terminals in mouse crista. Exp. Brain Res. 210, 607-621 (2011).
- Camp, A. J., Callister, R. J., Brichta, A. M. Inhibitory synaptic transmission differs in mouse type A and B medial vestibular nucleus neurons in vitro. J. Neurophysiol. 95, 3208-3218 (2006).
- Camp, A. J., et al. Attenuated glycine receptor function reduces excitability of mouse medial vestibular nucleus neurons. Neuroscience. 170, 348-360 (2010).
- Briggman, K. L., Euler, T. Bulk electroporation and population calcium imaging in the adult mammalian retina. J. Neurophysiol. 105, 2601-2609 (2011).
- Briggman, K. L., Helmstaedter, M., Denk, W. Wiring specificity in the direction-selectivity circuit of the retina. Nature. 471, 183-188 (2011).
- Rennie, K. J., Streeter, M. A. Voltage-dependent currents in isolated vestibular afferent calyx terminals. J. Neurophysiol. 95, 26-32 (2006).
- Hudspeth, A. J., Lewis, R. S. Kinetic analysis of voltage- and ion-dependent conductances in saccular hair cells of the bull-frog, Rana catesbeiana. J. Physiol. 400, 237-274 (1988).
- Rennie, K. J., Ashmore, J. F. Ionic currents in isolated vestibular hair cells from the guinea-pig crista ampullaris. Hear. Res. 51, 279-291 (1991).
