Elektrofizyoloji ve yüksek çözünürlüklü İki foton Mikroskopi için Fare Vestibüler Duyu epiteli bir İzole Yarı sağlam Hazırlık
Summary
Vestibüler saç hücre fonksiyonu analizi kafatası, petröz temporal kemiğin en zor kısmı içinde derin konumlarına göre karmaşıktır. En işlevsel saç hücre çalışmaları akut izole saç hücrelerinin kullandık. Burada elektrofizyolojik ve iki-fotonlu mikroskop çalışmaları için fare vestibüler epitelyum bir yarı sağlam hazırlanması açıklanmaktadır.
Abstract
Anlamak vestibüler saç hücreleri normal koşullar altında işlev, ya da ne kadar travma, hastalık, ve bu fonksiyon bozabilir yaşlanma önleyici yaklaşımlar ve / veya yeni tedavi stratejilerinin geliştirilmesi hayati bir adımdır. Ancak, anormal vestibüler fonksiyon bakarak çalışmaların çoğunluğu hücresel düzeyde olmuştur ama esas olarak yürüyüş analizleri ve vestibülookuler refleks performans olarak vestibüler fonksiyon bozukluğu davranış testleri odaklı değil. Bu iş terslik ne olur hakkında değerli bilgiler vermiştir olsa da, çok az bilgi disfonksiyon nedenleri ile ilgili toplanan edilir. Vestibüler fonksiyonu altında yatan hücresel ve hücre içi süreçleri odaklanmak çalışmaların, çoğu sinaptik bağlantıları ve destekleyici hücre çevre yoksun akut izole saç hücreleri, yararlanmıştır. Bu nedenle, büyük bir teknik meydan okuma bir hazırlık içinde zarif duyarlı vestibüler saç hücrelerinin erişimi olmuşturaration en fizyolojik, bozulur bu. Burada saç hücre / primer afferent kompleksleri dahil olmak üzere yerel mikro-çevre korur fare vestibüler duyu epitel bir yarı-sağlam hazırlık göstermektedir.
Introduction
Günlük hayatımıza vestibüler sistemin önemli bir katkı rağmen, yaşla birlikte vestibüler fonksiyonunda gözlenen düşüş sorumlu süreçlerin net bir anlayış zor kalır. Bu bilgi eksikliği bir nedeni vestibüler fonksiyonu bu düşüş neredeyse sadece vestibülookuler refleks (VOR), dışsal vestibüler fonksiyonun kesin bir gösterge dahil davranış testleri kullanılarak incelenmiştir, ancak içsel bileşenlerinin değişiklikleri içine sınırlı bilgiler sağlar . Bu sağlık, hastalık, ya da yaşlanma vestibüler saç hücre fonksiyonlarını daha iyi anlayabilmemiz için önemli bir engeldir.
Bireysel vestibüler saç hücrelerinin birçok çalışma varken, büyük bir eksiklik saç hücreleri ve hatta çanak afferent terminaller mekanik ve / veya enzimatik tedavi ile normal ortamdan kaldırılır akut saç hücresi hazırlıkları, üzerinde güven olmuştur. Bu tür yaklaşımlar kaçınılmazkızak kesici saç hücresi ve çanak ve saç hücre ve destekleyici hücre arasındaki hassas mikromimarisini bozabilir. Yarı sağlam hazırlıkları 1-5, ve izole bir fare labirent hazırlık 6 gelişmesiyle birlikte, daha yakından in vivo benzeyen bu koşullar altında sinaptik iletişim çeşitli şekillerde incelemek için bir fırsat şimdi var. Gerçekten de, Lim ve ark. (2011) I vestibüler saç hücreleri neuroepithelium içinde gömülü kaldığını kıyasla akut izole türünden kaydedilen tüm hücre akımları belirgin farklılıklar gösterdi. Özellikle, potasyum saç hücresi ve afferent çanak arasında, hücreler arası boşlukta birikir düşünülmektedir, ve önemli ölçüde saç hücresi yanıtı 7 değiştirebilir. Bu tür bilgiler burada açıklanan vestibüler duyusal epitelin yarı sağlam hazırlık olmadan elde etmek mümkün olacaktır. Biz fare krista 3 yarı sağlam hazırlık göstermekVe tam hücreli yama elektrofizyoloji elde edilen temsilcisi sonuçları ve iki foton kalsiyum görüntüleme göstermektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denge duygumuzu altında yatan mekanizmaları diğer duyu sistemleri ile karşılaştırıldığında sınırlı dikkat aldık, görsel ve işitsel sistemleri gibi. Vestibüler veya denge fonksiyonu değişiklikleri araştırdık çalışmaların, en denge-vestibüler saç hücrelerinin kendilerini temel yapı taşlarından eksik bilgi ile, vestibülookuler refleks dahil olmak üzere davranışsal tedbirler odaklanmıştır. Kendi ana ortamdan kaldırılır akut izole saç hücreleri kullanarak bunu saç hücre…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu iş için finansman R. Lim ve AJ Camp bir Garnett Passe ve Rodney Williams Memorial Foundation Projesi hibe tarafından sağlandı.
Materials
| REAGENTS | |||
| Leibovitz medium L-15 | Sigma Aldrich | L4386-10X1L | |
| BAPTA-1-oregon green | Invitrogen | O6806 | |
| EQUIPMENT | |||
| Stereo microscope | Leica Microsystems | A60S | |
| Upright microscope | Olympus | BX51WI | |
| Two-photon microscope | Olympus/La Vision | BX51WI/ TriMScope II | |
| Dumont #5 SF Forceps | FST | 11252-00 | |
| Friedman-Pearson Rongeurs | FST | 16221-14 | |
| Standard Pattern Scissors | FST | 14001-12 | |
| InstraTECH A-D converter | HEKA | ITC-18 | |
| Sutter Micromanipulator | Sutter | MP-225/M | |
| multiclamp amplifier | Axon Instruments | 700B | |
| Data acquisition software (electrophysiology) | Axograph | N/A | |
| Imspector Data acquisition software (two-photon) | Max Planck innovation | N/A |
References
- Dulon, D., Safieddine, S., Jones, S. M., Petit, C. Otoferlin is critical for a highly sensitive and linear calcium-dependent exocytosis at vestibular hair cell ribbon synapses. J. Neurosci. 29, 10474-10487 (2009).
- Highstein, S., Art, J., Holstein, G., Rabbitt, R. Simultaneous pre- and post-synaptic recording from the peripheral vestibular calyx and its included type I hair cell. , (2009).
- Kindig, A. E., Lim, R., Callister, R. J., Brichta, A. M. Voltage dependent currents in type I and II hair cell and calyx terminals of primary afferents in an intact in vitro mouse vestibular crista preparation. , (2009).
- Chatlani, S., Goldberg, J. M. Whole-cell recordings from calyx endings in the turtle posterior crista. , (2010).
- Songer, J. E., Eatock, R. A. Transduction in the mammalian saccule. , (2010).
- Lee, H. Y., Camp, A. J., Callister, R. J., Brichta, A. M. Vestibular primary afferent activity in an in vitro preparation of the mouse inner ear. J. Neurosci. Methods. 145, 73-87 (2005).
- Lim, R., Kindig, A. E., Donne, S. W., Callister, R. J., Brichta, A. M. Potassium accumulation between type I hair cells and calyx terminals in mouse crista. Exp. Brain Res. 210, 607-621 (2011).
- Camp, A. J., Callister, R. J., Brichta, A. M. Inhibitory synaptic transmission differs in mouse type A and B medial vestibular nucleus neurons in vitro. J. Neurophysiol. 95, 3208-3218 (2006).
- Camp, A. J., et al. Attenuated glycine receptor function reduces excitability of mouse medial vestibular nucleus neurons. Neuroscience. 170, 348-360 (2010).
- Briggman, K. L., Euler, T. Bulk electroporation and population calcium imaging in the adult mammalian retina. J. Neurophysiol. 105, 2601-2609 (2011).
- Briggman, K. L., Helmstaedter, M., Denk, W. Wiring specificity in the direction-selectivity circuit of the retina. Nature. 471, 183-188 (2011).
- Rennie, K. J., Streeter, M. A. Voltage-dependent currents in isolated vestibular afferent calyx terminals. J. Neurophysiol. 95, 26-32 (2006).
- Hudspeth, A. J., Lewis, R. S. Kinetic analysis of voltage- and ion-dependent conductances in saccular hair cells of the bull-frog, Rana catesbeiana. J. Physiol. 400, 237-274 (1988).
- Rennie, K. J., Ashmore, J. F. Ionic currents in isolated vestibular hair cells from the guinea-pig crista ampullaris. Hear. Res. 51, 279-291 (1991).
