Uma preparação semi-intactas isolada do Rato Vestibular epitélio sensorial de Eletrofisiologia e de alta resolução Microscopia de dois fótons
Summary
Análise da função das células ciliadas vestibular é complicada por sua localização profunda na parte mais difícil do crânio, no osso temporal petroso. A maioria dos estudos com células capilares funcionais têm utilizado intensamente as células ciliadas isoladas. Aqui nós descrevemos uma preparação semi-intactos do epitélio vestibular rato para estudos eletrofisiológicos e de microscopia de dois fótons.
Abstract
Compreender as células ciliadas vestibulares funcionar em condições normais, ou como trauma, doenças e envelhecimento interromper esta função é um passo vital para o desenvolvimento de abordagens preventivas e / ou estratégias terapêuticas. No entanto, a maioria dos estudos com vista a função vestibular anormal não ter sido a nível celular, mas focado principalmente em ensaios comportamentais de disfunção vestibular, tais como análises de marcha e desempenho reflexo vestíbulo-ocular. Embora este trabalho rendeu dados valiosos sobre o que acontece quando as coisas dão errado, pouca informação é recolhida sobre as causas da disfunção. Dos estudos que incidem sobre os processos celulares e subcelulares que fundamentam função vestibular, a maioria têm contado com agudamente células ciliadas isoladas, desprovidas de suas conexões sinápticas e meio ambiente da célula de apoio. Por isso, um grande desafio técnico tem sido o acesso às células ciliadas vestibulares extremamente sensíveis em uma preparaçãoparação que é menos interrompido, fisiologicamente. Aqui demonstramos uma preparação semi-intactas do mouse vestibular epitélio sensorial que mantém o micro-ambiente local, incluindo células ciliadas / complexos aferentes primários.
Introduction
Apesar da contribuição significativa do sistema vestibular em nossas vidas cotidianas, um claro entendimento dos processos responsáveis pelo declínio observado na função vestibular com a idade são ainda imperceptíveis. Uma das razões para essa falta de conhecimento é que o declínio da função vestibular foi quase exclusivamente explorado utilizando testes comportamentais, incluindo o reflexo vestíbulo-ocular (RVO), um indicador preciso da função vestibular extrínseca, mas fornece informações limitadas sobre as mudanças de componentes intrínsecos . Este é um grande impedimento para a nossa compreensão da função das células ciliadas vestibular na saúde, doença ou envelhecimento.
Embora tenha havido muitos estudos sobre as células ciliadas vestibulares individuais, uma grande lacuna tem sido o recurso a preparações de células capilares agudas, onde as células do cabelo e terminais aferentes até cálice são removidos do seu ambiente normal através de tratamento mecânico e / ou enzimático. Tais abordagens inevitably perturbar a microarquitetura delicado entre células ciliadas e cálice, e os cabelos célula e célula de apoio. Com o desenvolvimento de preparações semi-intactas 1-5, e um isolado do rato de preparação de labirinto 6, existe agora uma oportunidade de estudar as diversas formas de comunicação sináptica sob condições que se aproximam mais in vivo. Na verdade, Lim et al. (2011) mostrou diferenças marcantes nas correntes de células inteiras gravadas de tipo agudo isolado I células ciliadas vestibulares em comparação com aqueles que permaneceram incorporado dentro do neuroepithelium. Especificamente, o potássio é pensado que se acumulam no espaço intercelular, entre a célula de cabelo e cálice aferentes, e altera significativamente a resposta das células ciliadas 7. Este tipo de informações pode ser impossível de obter, sem a preparação de semi-intacta do epitélio sensitivo vestibular descrito aqui. Nós demonstramos a preparação semi-intactas do mouse crista 3E mostram resultados representativos obtidos patch-célula inteira eletrofisiologia e de imagem de cálcio de dois fótons.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os mecanismos subjacentes a nosso senso de equilíbrio têm recebido pouca atenção em comparação com outros sistemas sensoriais, por exemplo, os sistemas visual e auditivo. Dos estudos que investigaram alterações na função vestibular ou de equilíbrio, a maioria focada em medidas comportamentais, incluindo o reflexo vestíbulo-ocular, com conhecimento incompleto dos blocos de construção fundamentais da balança as próprias células ciliadas vestibulares. Esses estudos que se concentraram nas células…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O financiamento para este trabalho foi fornecido por uma Garnett Passe e Rodney Williams Memorial Foundation projeto de Subsídio à R. Lim e AJ Camp.
Materials
| REAGENTS | |||
| Leibovitz medium L-15 | Sigma Aldrich | L4386-10X1L | |
| BAPTA-1-oregon green | Invitrogen | O6806 | |
| EQUIPMENT | |||
| Stereo microscope | Leica Microsystems | A60S | |
| Upright microscope | Olympus | BX51WI | |
| Two-photon microscope | Olympus/La Vision | BX51WI/ TriMScope II | |
| Dumont #5 SF Forceps | FST | 11252-00 | |
| Friedman-Pearson Rongeurs | FST | 16221-14 | |
| Standard Pattern Scissors | FST | 14001-12 | |
| InstraTECH A-D converter | HEKA | ITC-18 | |
| Sutter Micromanipulator | Sutter | MP-225/M | |
| multiclamp amplifier | Axon Instruments | 700B | |
| Data acquisition software (electrophysiology) | Axograph | N/A | |
| Imspector Data acquisition software (two-photon) | Max Planck innovation | N/A |
References
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