Gaz kromatografisi ile operant etanol kendi kendine uygulama ve etanol belirleme sırasında etanol mikrodivaliz

1. Stereotaksik Cerrahi Tüm prosedürler Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı için NIH Kılavuzu izleyin ve Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmıştır. Bir stereotaksik aparat kullanarak, Long-Evans izofluran ile anestezi fareler, faiz beyin bölgesi üzerinde bir 21-gauge kanül (daha sonra microdilaysis prob yerleştirme için) (Plastik biri, Roanoke, VA) ile implante edilir ve bir ip iyi ele cıvata kafa sahne (mikrodiyaliz cihazları desteklemek için kullanılan) içine inşa edilmiştir. Ameliyat sırasında ve sonrasında dikkatle sıçanlarda izleyin. Tüm hayvanlar ameliyat sonrası bakım ve iyileşme en az bir hafta alır ve aşağıdaki işlemleri başlamadan önce sağlıklı olduğundan emin olun. Stereotaksik cerrahi yöntemin Jüpiter Video kullanılabilir. 1 2. Edimsel Eğitim Ameliyat sonrası iyileşme bir hafta sonra, hayvanların% 10 sakkaroz eriyik için kolu basın için eğitilmişlerdirn lickometer, geri çekilebilir kolu, ve sipper tüp (daha önce Howard ve ark., 2009'da tarif edildiği gibi) ile donatılmış bir Med Associates operant bölmesinin (MedAssociates, Inc, Vermont, ABD). MedAssociates 2 Software tüm tasarlamak için kullanılmıştır edimsel programları (MedAssociates, Inc, Vermont, USA). Bir kere, sakaroz için yanıt etanol kademeli birden içme oturumları çözeltisine eklenir sırasında uygun bir eğitim programı üzerinde sıçanlar başlamak için eğitilmiştir. Örneğin, bizim laboratuvar anda etanol% 10 etanol /% 10 sakaroz içme çözeltisi sonuçlanan çözüm içine soluk bir 8 günlük bir eğitim programı kullanmaktadır. Kontrol hayvanlarına sadece% 10 sakkaroz veya içme çözüm alırsınız. Kullanılmak için operant programı belli tür yaygın olarak değişebilir, fakat mikro-diyaliz numune için aşağıda tarif edilen genel prosedürler yine de gerçekleştirilebilir. 3 3. Ön mikrodiyaliz Prosedürleri: Bağ <ol> Geçen eğitim oturumu (bizim örneğimizde bu 7. eğitim oturumu) için ikinci bir gece önce, hayvanların baş sahnede tether cıvata takılır tether bahar alışmışsındır. Bahar hayvan kafesi içinde serbestçe hareket böylece bir halka standı ve kelepçeler ile kafesi yanında askıya mikrodiyaliz döner ve karşı denge kol, bağlanır. Gergin hayvanlar tethering onları set-up alıştırmak için, ad libitum gıda ve su ile evlerinde kafeste, edimsel odasında gece geçirmek. Ertesi gün, sıçan davranışsal görevleri yerine getirirken halata hissi hayvan alıştırmak için, bir yerde ip ile edimsel programını tamamlar. Edimsel odasının tavanının ortasına yukarıdaki halata ve döner askıya izin üstüne yakın edimsel odasının duvarına bağlanıyor aparatı monte edin. Tüm bu ses zayıflatma odasına yerleştirilir. After oturumu microdiaysis prob yerleştirilmesi beklemek edimsel odasında onun ev kafesine sıçan dönün. 4. Ön mikrodiyaliz Prosedürleri: sıçan gün için davranışsal eğitim tamamlandıktan sonra mikrodiyaliz prob, mikrodiyaliz deneyinin bir gün önce eklenir Gergin ise, izofluran ile sıçan uyutmak ve kılavuz kanül gelen obturator kaldırmak mikrodiyaliz deneyden önce gün, sıçan sonra edimsel oturumu tamamlandı. Yavaşça (5 ~ üzerinde dak) faiz beyin bölgeye kranial kılavuz kanül aracılığıyla yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF) ile perfüze bir mikrodiyaliz prob, takın. Biz laboratuvar inşa probları ve Doyon ve ark., 2003 ve Pettit ve Adalet, 1991'den sonra modellenmiş mikrodiyaliz yordamları kullanın. 3, 4 Hayvan Yukarıdaki prob giriş ve çıkış hatları askıya önce tartışılan tethering aparatı kullanın. P çevirinrobe debisi 0.2 ul / dak aşağı. Bir kez daha, sıçan edimsel odasında gece geçirir. 5. Mikrodivaliz Prosedürler: numuneleri ayrılmış iştahlı ve consummatory evreleri ile öz-yönetim oturumu sırasında Deney başlamadan en az 2 saat önce, çalışma akış oranına prob kadar açmak. Biz 1.0 veya 2.0 ul / beyin bölgesine bağlı olarak min kullanabilirsiniz. Sonda akış oranı tutarlı olduğunu kontrol edin, ve zaman içinde hacim ölçmek için bir Hamilton şırıngası kullanılarak grubu akış oranının en az% 90 olmalıdır. Diyaliz örnekleri (5 veya 7 dakika) sırasında ve edimsel seanstan sonra, önce alınır. Numune aralığı beyin bölgesinde bağlıdır, nörotransmiter analiz edilen, analit konsantrasyonunun ve analiz için kullanılacak analitik kimya ekipman duyarlılık diyaliz. Davranışsal aşamaları aşağıdaki gibidir: Baseline: Denemenin başında,hayvanın evi kafesi (4 örnek) diyaliz örnekleri toplamak. Transferi: evde kafes temel örnekleri toplandıktan sonra, edimsel odasına sıçan aktarın. Tethered sıçan Transferi aşırı dikkat mikrodiyaliz akışkan transfer hattı karışık hale gelir ve sıçan sakin kalmasını etmediğinden emin olmak için gereklidir. Eğer ilk beklemek örnek taban / transferi örneği değiştirmek gibi hemen transferinden sonra, edimsel programını etkinleştirin. Bekle: sıçan odası (beyin bölgeye göre 3-4 numune) içine uzatmak için kolu bekler gibi örnekleri toplamak için devam edin. Alkol: kolu sunulmuştur ve basıldıktan sonra, içme çözeltisi (% 10 sucrose/10% etanol veya% 10 sukroz), bir şişe yaklaşık 20 dakika (3-4 numunelerde) sıçan için uygun hale getirilir. Post-içecek: içecek süresinden sonra, şişe geri çeker, ama fare kalır in yaklaşık 20 dakika (3-4 numune) için edimsel odası. 6. Mikrodivaliz Prosedürler: etanol analiz için numune hazırlanması mikrodiyaliz , Etanol konsantrasyonu açısından değerlendirilmiştir sonra hayvanlara daha önce iki numune etil alkol çözeltisi, ve tüm örnekler kendi kendilerine uygulamaktadır. Pipet ya da 2 ml'lik cam şişe içine ilgi örnek bir 1 ya da 2 ul alikot. Sonra bir hava geçirmez septum (9 mm Kırmızı Poly Vida Kapağı, PTFE / Sil Bölme, Agilent Technologies) ile flakon mühür. Etanol analiz kısım (1 ya da 2 ul) ve hacim toplam örnek hacminin, ve herhangi bir ek analizler için gerekli numune hacmine bağlıdır. Örnekleri daha sonra nörokimyasal analiz için kullanılacak ise, uygun etanol tayini için tablet pipetleme sonra numune saklamak. Örneğin, bizim laboratuvar dopamin için örnekleri inceliyor. Bunu gerçekleştirmek için, deney sırasında kuru buz örnekleri yerve daha sonra, deney sonra -80 ° C de örnekleri saklayın. Biz, 2.0 ul / nucleus accumbens yerleştirilen problar için dak 'lık bir akış oranı ile bir araya toplanan numune 5 dakika etanol analiz için 2 ul hacimde kullanılır. Bu elektrokimyasal algılama ile yüksek performanslı sıvı kromatografisi ile dopamin sonra analiz için kalan en az 7 ul sağlar. Çok daha düşük konsantrasyonlarda hücre dışı dopamin sahip prefrontal korteks, alınan numuneler için, 1.0 ul / dak 'lık bir akış oranı kullanılarak bir min 7-numune alınmıştır etanol analizi için 1 ul alikot kullanır. 7. Post-mikrodiyaliz prosedürleri Mikrodiyaliz Deneyin tamamlanmasından sonra, sıçan uyutmak ve prob çıkarın. Hayvan hemen ötenazi değilse, tıkayıcı değiştirin. Deneme üç gün içinde beyin toplayın. Aksi takdirde, sonda yolu görüntüleme mümkün olmayabilir. Beyin i kaldırılması gerekironaylanmış hayvan kullanımını protokolleri n uygun. Biz tuzlu tuzlu ve sonra formalin ile kardiyak perfüzyon ardından sodyum pentobarbital (150 mg / kg, ip) dozda kullanın. Kesit önce en az 12 saat boyunca bir formalin-tuzlu su çözeltisine daldırın beyin. Koronal bölümünde 100 mikron dilimler halinde beyin. Cresyl mor dilimleri Leke ve doğru prob yerleştirme için inceleyin. 5, 6 8. Etanol konsantrasyonu için numune analizi Toplanan örnekler yanı sıra harici standartlar (0,3125-20 mM etanol) alev iyonizasyon algılama sistemi ile gaz kromatografisi üzerinde çalıştırılır. Bu sistem, bir alev iyonizasyon detektörü ile bir Varian CP 3800 gaz kromatografı oluşur, bir Bruker (Varian) 8400 tepe boşluğunun, otomatik örnekleyici ° C, ve bir HP Innowax kılcal sütun (30 mx 0.53 mm x 1.0 um kalınlığındaki film,), 50 ile ısıtıldı mobil faz olarak helyum. Kromatogramlar kromatografl ile birlikte kaydedilir ve analiz edilirBöyle burada özellikle ele alınacak Varian Yıldız Kromatografi Workstation yazılımı olarak aphy yazılımı. Etanol analizi için sistem hazırlamak için, bir çevrimli su banyosu kullanılarak Otosampler plaka ısı ve iki ek gaz tankları (hava ve hidrojen, helyum daima balmumu sütun korumak için çalışan sol) açın. Septum, basınç gaz tankı, hem de Eğer fiber septum ve bunlar, uygun olduğunda (lif-500 enjeksiyonlar değiştirilebilir, böylece kullanılmış olan kez sayısı sayısı tutmak, böylece olcam numune sayısını kaydedin -100 delikler). Örnekleri (Tablo 2 program parametreleri) çalıştırmak için sistemi hazırlar start-up yöntemi başlatın. O "hazır" olduğunu bildirmek için sistem için bekleyin. 20 dakika herhangi o emmiş kirlenmektedir desorb için yüksek bir sıcaklığa tabi tutarak analiz için numune elyaf hazırlar, "yanma" başlatma hareketsiz iken. Standartlarına göre yapılırKimyasal bir çeker ocak içinde bir balon jojeye ile 100 mL 'lik bir son hacim su ile% 95 etanol ve 238 ul seyreltmek. Bu, bir 40 mM etanol çözeltisi oluşturur. Biz 20, 10 oluşturmak için bir 1:1 seri seyreltme, 5, 2.5, 1.25, 0.625, 0.3125 mM standartları kullanıyor. Standart her bir konsantrasyonu için, diyaliz örnekler alınacak aynı birimde tablet kullanılır. 2 ml bir cam şişe içine tablet pipet, ve daha sonra bir hava geçirmez septum ile şişe sızdırmaz. Tüm sıvı kısım buharlaştırılır kadar tüm örnekler etanol otomatik numune alıcı içinde ısıtılır. Biz yaklaşık 30 dakika bizim örnekleri ısıtmak. Bu bölümde bizim gaz kromatografisi ile kullandığınız Yıldız Workstation yazılımı anlatılmaktadır. Başka yazılım kullanılabilir, ancak aşağıda açıklaması uygulanabilir olmayabilir. Örnekleri çalıştırmak için, örnek hangi Otosampler yuvasında olduğu belirterek örnek bir liste oluşturmak ve örnek kaç kez delinmiş olmalıdır. Seçtiğiniz kat rota veri dosyaları emin oluner. Ardından, örnekleri için tercih edilen yöntemi seçin ve çalışma başlar. Biz Tablo 2'de belirtildiği çalışan parametrelerini kullanın. Bizim diyalizat etanol programı 3 dakika boyunca örnek emer ve 1 dakika boyunca, balmumu sütuna besleyen helyum akışı içine desorbs. Ancak, programların belirli ihtiyaçlarınızı karşılamak için yazılmış olabilir. Sonra balmumu sütunda ayrı ve örnek bileşenleri alev iyonizasyon dedektörü ile nereye örneğin etanol, yanma ve serbest iyonlar gibi bileşikler içeren karbon. Dedektörün anot gelen voltaj ile dönüştürülmüş ve (Şekil 1) aşağıda gösterildiği gibi kromatogramları ile sonuçlanan kayıtlı olduğu, bir akım yaratmak için artan bir katot elektron akım elde edilir. Voltaj değişim time.7 karşısında detektör içinden geçen karbon miktarı ile orantılıdır Sistem numune çalışması bittikten sonra, her tepe entegrasyonu kontrol etmek gerekir. Yıldız Workstation yazılımı için,araç çubuğunda mavi tepe simgesine tıklayın. Her pikin renk üzerine tıklayın ve taban ayarlamak için okları sürükleyin. Piklerinin sonraki grup üzerine geçmeden önce her pik yeniden entegre. Pik analiz yazılımı herhangi bir genel kromatografisi yazılımı olabilir. Yıldız Workstation yazılımı için, araç çubuğunda toplu rapor simgesine tıklayın. Sizin belirttiğiniz klasördeki örnek raporları yazdırmak için toplu rapora her örnek sürükleyin. Raporlama yazılımı en yaygın kromatografisi yazılım sistemleri ile özelleştirilebilir. Raporlar seçtiğiniz bilgileri göstermek için programlanmış olabilir. Şu anda pik yüksekliği kullanabilirsiniz, ancak raporları da pik alanı kullanmak için programlanmış olabilir. Sistemi kapatmak için kapatma yöntemi (parametreler Tablo 2'de belirtildiği gibi) başlatmak, su banyosu kapatın ve kolon fırını sıcaklığı 30 ° C'ye ulaştığında, hidrojen ve hava tankları kapatın 9. Etanol Veri Pik yüksekliği olarak çizilirbilinen her dış standart etanol konsantrasyonunun bir fonksiyonu (Şekil 2A). Her diyalizat örneği tarafından verilen pik yüksekliği gelen etanol konsantrasyonu hesaplamak için bu noktaları tarafından verilen lineer işlevini kullanın. Saat boyunca diyaliz etanol konsantrasyonu grafiğini çizerek, bizim davranış oturum sırasında ilgi beyin bölgesi içinde etanol seviyesinin kalıp görebilir. (Şekil 2B) aşağıda gösterilen örnek veriler, kendi kendine uygulama oturum sırasında zaman karşısında diyaliz etanol konsantrasyonu olarak gösterilir. 10. Genel Bakım: Fiber her 500 delikler ve septum değiştirilmesi gerektiğini her 100 delikler Lif değiştirmek için Gaz kromatografisi tuş takımı Menü düğmesine basın, seçim 8400, enter tuşuna basın; değişim şırınga seçin, Enter tuşuna basın. Otosampler izin kendini konumlandırmak olacaktır lif (SPME Fiber Meclisi, 75 mikron Carboxen-PDMS, Supelco Analitik, Bellefonte, PA) kaldırılacak. Fiber kaplama kapağını açın. Kontra somunu, ve elyaf montaj kaldırılması için izin vermek için hareket mandalı. Lif takımını çıkarın. Sökün sonra montaj fiber tutar ve somun lif sökün. Yenisi ile eski lif değiştirin ve fiber montaj yenilemek. , Otomatik örnekleyici derleme değiştirin tekrar kilitlemeli ve yerine montajı vidalama. İşiniz bittiğinde, tuş takımındaki "değiştirmek done" tuşuna basın ve otomatik örnekleyici kullanımı için kendisini hazır olacak. Septum değiştirmek için Birincisi, sökün sonra septum (Hi-Temp 0,450 Dia. Jenerik Şartlanmış Bölme, Varian) kapsayan kapağı ve eski septum çıkarın. Uydurma aşağı Seat yeni septum. Kapağı tekrar vidalayın ve anahtarı ile sıkın. Lif septumun delinmiş ilk kez kırmak olmaz, böylece Ardından, delinme septumun bir enjeksiyon iğnesi kullanın. </ol> 11. Temsilcisi Sonuçlar Şekil 1, etanol standartların konsantrasyonu için üç ve etanol kendi kendine uygulama oturum sonunda bir araya toplanan diyalizat sıçan numune için örnek kromatogramları göstermektedir. Etanol zirveleri, nispeten simetrik olması tutarlı tutma süreleri var ve gürültü oranı> 10 için bir sinyal olmalıdır. Bu kriterlere uyulmaması sistem bakım gerektirir anlamına gelir. Kalite kromatografisi ve düzgün hazırlanmış standartlar doğrusal bir standart eğri (R2 ≥ 0.99; Şekil 2A) üretmek etanol toplanan diyalizat örneklerinin etanol konsantrasyonu hesaplamak için kullanılan öz idare kendi öz-yönetim oturumu sırasında (Şekil 2B) fazla hayvan . 1. Örnek kromatogramları Şekil. Etanol standart ya da numune diyalizat bir mikrolitrelik bir gaz c içine yüklendişişeye hromatograph ve metin içinde anlatıldığı gibi analiz edilmiştir. 2.5, 5.0 ve 10 mM etanol standartları elde edilen tepe noktalarının A) Kaplama. B) Tepe kendi kontrolünde etanol olan bir sıçan bir diyalizat örneği oluşturulur. Şekil 2,. Şekil 1'de gösterilen örnek deney grafiksel sonuçlanır. A) Etanol standart eğri. Bir etanol kendinden-yönetim oturumu boyunca diyalizat etanol konsantrasyonu B) Zaman kursu. Donanım Parametre Start-up ayarı Ayarı Koşu Dinlenme ayarı 8400 Bruker (Varian) Autosampler Enjeksiyon modu SPME SPME n / a <tr> Solvent nüfuz derinliği 0% % 20 n / a Örnek penetrasyon derinliği % 20 % 20 n / a Emme zamanı 0.01 dk 3 dk n / a Desorpsiyon zamanı 19 dk 1 dakika n / a Modu çözücü kaynağı temizleyin Ben Ben n / a Temiz modu adsorpsiyon ve desorpsiyon zamanı 0.01 dk 0.01 dk n / a Su banyosu (Otosampler ısıtır) * 50 ° C 50 ° C Kapalı CP-3800 Varian Gaz Kromatografi Enjektör Fırın </td> Fırın gücü Üzerinde Üzerinde Üzerinde Fırın sıcaklığı 250 ° C 220 ° C 30 ° C Kolon Fırını Stabilizasyon süresi 0.10 dk 0.10 dk 0.10min Sıcaklık 65 ° C 65 ° C 30 ° C Sütun Mobil faz akış hızı 8.5 ml / dak 8.5 ml / dak n / a Sütun basmalı ~ 6 psi ~ 6 psi ≥ 0.1 psi FID dedektörü Fırın gücü Üzerinde Üzerinde Üzerinde Sıcaklık 220 ° C 220 ° C 120 ° C </tr> Elektronik Üzerinde Üzerinde Kapalı Zaman sabiti Hızlı Hızlı Hızlı Menzil 11 11 11 Autozero Evet Evet Evet Alev iyonizasyon algılama sistemi parametreleri Tablo 2. Gaz kromatograf. Bu tablo hazırlamak için kullanılan üç program için parametreler (start-up ayarları), run (ayarlar çalıştıran) gösterir ve sistemi korumak değil kullanmak (istirahat ayarları) iken.