ガスクロマトグラフィーによるオペラントエタノール自己投与とエタノール判別中エタノールのマイクロダイアリシス

1。定位手術すべての手順は、実験動物の管理と使用のためのNIHのガイドに従い、施設内動物のケアと使用委員会によって承認された。 イソフルランで麻酔し定位固定装置を用いて、よく扱わLong-Evansラット、関心のある脳領域と、上記のテザー（プラスチックワン、ロアノーク、バージニア州）（後microdilaysisプローブ挿入用）、21ゲージのカニューレで注入さボルトは、ヘッドステージ（微小透析機器をサポートするために使用される）に組み込まれています。 手術中と後に慎重にラットを監視します。すべての動物は、外科手術後のケアと回復の少なくとも一週間を受信し、次の手順を開始する前に、健康であることを確認してください。定位手術法のJoveのビデオは入手可能です。1 2。オペラントトレーニング手術後の回復の一週間後、動物は10％スクロースsolutio用レバー押すように訓練されるMedAssociatesからn lickometer、リトラクタブルレバー、シッパーチューブ（以前Howardらで説明したように、2009年）を装備メッドアソシエイツオペラントチャンバー（MedAssociates社、バーモント州、米国）インチ2ソフトウェアは、すべてを設計するために使用されているオペラントプログラム（MedAssociates社、バーモント州、米国）。 一度、スクロース応じるエタノールを徐々に複数の飲み会以上溶液に添加されている間の適切なトレーニングスケジュールでラットを開始するために訓練した。 たとえば、私たちの研究室では現在、エタノールは10％エタノール/ 10％ショ糖飲料溶液中で最高潮に達するソリューションに色あせている8日間のトレーニングスケジュールが使用されます。対照動物にはわずか10％のスクロースまたはno飲料ソリューションを受け取る。使用するオペラントスケジュールの特定のタイプは大きく異なる場合がありますが、マイクロダイアリシスのサンプリングには、後述する一般的な手順は、引き続き行うことができる。3 3。プリマイクロダイアリシス手順：テザリング<ol> 最後のトレーニングセッション（この例では、これは第 7 回のトレーニングセッションである）の二番目の前の夜は、動物が自分の頭の舞台でテザーボルトにアタッチテザー春、に慣らされています。春は動物がケージ内を自由に移動できるように、リングスタンドとクランプをケージの隣に中断されているマイクロダイアリスイベルとカウンターバランスレバーアームに取り付けます。テザー動物はテザリングセットアップにそれらを慣らすために、不断の食料と水で彼らのホームケージで、オペラント部屋で夜を過ごす。 翌日、ラットは、その行動のタスクを実行中にテザー感に動物を慣らすために、所定の位置にテザーとのオペラントプログラムを完了します。オペラント室の屋根の中央に上記のテザーとスイベルの懸濁液を可能にするために先頭付近にオペラントチャンバーの壁に係留装置をマウントします。このすべてが、音響減衰チャンバー内に配置されます。 AfteRセッション、microdiaysisプローブの挿入を​​待つために、オペラント部屋でそのホームケージにラットを返す。 4。プリマイクロダイアリシス手順：ラットは、その日の行動訓練を完了した後にマイクロダイアリシスプローブは、マイクロダイアリシス実験の前日に挿入されているつながれながら、ネズミがオペラントセッションを完了した後、微小透析実験の前日には、イソフルランでラットを麻酔し、ガイドカニューレからオブチュレータを取り外します。徐々に（約5分かけて）興味のある脳領域に頭蓋ガイドカニューレを介して人工脳脊髄液（ACSF）で灌流マイクロダイアリシスプローブを挿入します。我々は、実験室に構築プローブとDoyonら、2003、ペティットと正義、1991年モデルにしたマイクロダイアリシス·プロシージャを使用する。3、4 動物上記プローブの入口と出口のラインを一時停止する以前に議論テザリング装置を使用しています。 pを回しローブ流量0.2μL/分にダウン。もう一度、ラットは、オペラント部屋で夜を過ごしています。 5。マイクロダイアリシス手順：分離欲求とコンサマトリー相と自己管理セッション中にサンプルのコレクション実験が始まる少なくとも2時間前に、その作業の流量にプローブを上げてください。私たちは、脳の領域に応じて1.0または2.0のどちらかμL/分を使用しています。プローブ流量が一貫していることを確認し、時間をかけて体積を測定するためにハミルトンシリンジを使用して設定された流量の少なくとも90％である。 透析サンプル（5または7分）の間、およびオペラントセッションの後、前に取得されます。サンプリング間隔は脳領域に依存し、神経伝達物質が分析されて、分析対象物の濃度、および分析に使用する分析化学機器の感度を透析液。行動のフェーズは次のとおりです。 ベースライン：実験の開始時に、動物のホームケージで透析サンプルを収集（4サンプル）。 転送：ホームケージのベースラインのサンプルを集めた後、オペラントチャンバーにラットを転送します。テザーラットの移転は、マイクロダイアリシス流体移送ラインが絡まりないことを確認するために細心の注意を必要とし、ラットが落ち着いたままであること。あなたが最初の待機サンプルにベースライン/転送のサンプルから変更するとすぐに転送後、オペラントプログラムをアクティブにします。 待機：ラット室（脳の領域に応じて3から4サンプル）にはみ出させるレバーを待っている間にサンプルを収集し続けます。 酒：レバーが提示され、押された後、飲料溶液（10％sucrose/10％エタノールまたは10％ショ糖）のボトルが約20分（3-4サンプル）のラットを使用できるようになります。 ポスト飲酒：飲酒期間の後、ボトル引っ込みが、ラットが残って私約20分（3-4サンプル）に対するnオペラントチャンバー。 6。マイクロダイアリシス手順：エタノール分析用マイクロダイアリシスサンプルの調製 、エタノール濃度について評価された後の動物の前に2つのサンプルは、エタノール溶液、およびすべてのサンプルを自己投与する。ピペットのいずれか2 mlのガラスバイアルに興味のあるサンプルからの1または2の10μlアリコート。その後気密隔壁（9ミリメートルレッドポリスクリューキャップ、PTFE / Silのセプタムは、Agilent Technologies）を用いてバイアルを密封します。エタノール分析アリコート（1または2μL）の体積は、総サンプル量、および任意の追加的な分析に必要な試料の量によって異なります。 サンプルは後で神経化学分析に使用する場合は、適切にエタノールの定量化のためのアリコートをピペッティングした後にサンプルを保存します。 たとえば、私たちのラボは、ドーパミンのサンプルを分析します。これを達成するために、実験中にドライアイス上にサンプルを配置その後、実験後-80℃でサンプルを格納します。我々は、側坐核に配置されたプローブのための2.0μL/分の流量を使用して収集さ5分のサンプルのエタノールの分析のための2μlアリコートを使用しています。これは、電気化学検出高速液体クロマトグラフィーによるドーパミンの後の分析のための残りの少なくとも7μlを可能にします。 はるかに低い細胞外ドーパミン濃度を有する前頭前野から採取したサンプルのために、私たちは1.0μL/ minの流量を使って7分のサンプルから取らエタノール分析に1μlのアリコートを使用しています。 7。ポスト·マイクロダイアリシス手続きマイクロダイアリシス実験の終了後、ラットを麻酔し、プローブを取り外す。動物はすぐに安楽死されていない場合、閉塞具を交換してください。実験の3日以内の脳を収集します。それ以外の場合は、プローブ管の可視化が可能でないかもしれません。 脳は、iを削除する必要があります承認された動物の使用プロトコルでのn準拠。私たちは、生理食塩水、生理食塩水でその後ホルマリンで心臓灌流続いペントバルビタールナトリウム（150 mg / kgで、ip）を過剰摂取、使用しています。セクショニングの前に少なくとも12時間ホルマリン食塩水に沈め脳。 歯冠部100μmのスライスに脳。クレシルバイオレットでスライスを染色し、正しいプローブの配置についても検討を行う。5,6 8。エタノール濃度のサンプルの分析収集されたサンプルだけでなく、外部基準（0.3125から20 mMのエタノール）は、水素炎イオン化検出システムとのガスクロマトグラフ上で実行されます。このシステムは、水素炎イオン化検出器を備えたバリアンのCP 3800ガスクロマトグラフで構成され、ブルカー（バリアン）8400ヘッドスペースオートサンプラは、°C、およびHP Innowaxキャピラリカラム（30 mxの0.53ミリメートル×1.0μmの膜厚）で50に加熱移動相としてヘリウム。 クロマトグラムはchromatogrで記録され、分析されそのような具体的にここで議論されるバリアンスタークロマトグラフィーワークステーションソフトウェアなどaphyソフトウェア。 エタノールの分析のためにシステムを準備するには、再循環水浴を用いてオートサンプラの板を加熱、および2つの追加のガスタンク（空気と水素、ヘリウムは常にワックス列を保持するために実行されたままである）を開きます。 セプタム、ガスタンクの圧力だけでなく、あなたが繊維とセプタムは、それらが適切な場合（ファイバ-500注射を変更することができるようにするために使用された回数のカウントを維持することができるように実行しようとしているサンプルの数を記録-100穿刺）。 サンプル（表2のプログラムのパラメータ）を実行するためのシステムを準備し、起動方法を、開始します。それが "準備完了"であることを報告してシステムを待つ。 20分のいずれかが、それが吸収した汚染脱着する高温に供することにより試料分析のための繊維を準備している "焼く"を開始安静時間。 標準はによって作られていケミカルドラフト内でメスフラスコを用いて、100 mLの最終体積に水での95％エタノールを238μlの希釈。これは、40mMのエタノール溶液を作成します。我々は、20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125 mMの基準を作成するために1:1シリアル希釈を使用しています。標準の各濃度は、透析サンプルから取られる、同じボリュームのアリコートを使用しています。 2 mlのガラスバイアルにアリコートをピペットで、次に気密隔壁でバイアルを密封します。 全体の液体のアリコートが気化されるまで、すべてのエタノールサンプルはオートサンプラで加熱される。私たちは約30分間私達のサンプルを加熱する。 このセクションでは、我々はガスクロマトグラフで使用しているスター·ワークステーションのソフトウェアについて説明します。他のソフトウェアを使用することができるが、以下の説明は、適切でないかもしれません。 サンプルを実行するには、サンプルがどのオートサンプラスロットになっていると指摘サンプルリストを作成し、サンプルは何回パンクしなければならない。あなたの選択された折りにルーティングするデータファイルへ必ずえー。次に、サンプルのための選択の方法を選択し、実行を開始します。我々は、表2に記載されて実行されているパラメータを使用します。 当社の透析液エタノールプログラムは3分間サンプルを吸収して1分間、ワックスカラムに送り込まヘリウムストリームに脱着する。しかし、プログラムは、特定のニーズに対応するために書き込むことができます。 炭素は、例えば、エタノール、燃焼およびリリースイオンなどの化合物を含有する水素炎イオン化検出器を通過した後ワックスカラムで分離し、試料成分。検出器のアノードからの電圧に変換されます（図1）以下に示すようなクロマトグラムの結果が記録され、現在作成カソードに増加した電子の流れでこの結果。電圧の変化はtime.7渡っ検出器を通過した炭素の量に比例しているシステムは、サンプルを実行して終了した後は、各ピークの積分をチェックする必要があります。スター·ワークステーションのソフトウェアについては、ツール·バーの青色ピークのアイコンをクリックしてください。各ピークの色をクリックして、ベースラインを調整するには、矢印をドラッグします。ピークの次のグループに移る前に、各ピークを再統合。ピーク解析ソフトウェアは、任意の一般的なクロマトグラフィソフトウェアすることができます。 スターWorkstationソフトウェアは、お使いのツール·バーのバッチレポートのアイコンをクリックしてください。サンプルレポートを印刷するには、バッチレポートにあなたの指定したフォルダから、各サンプルをドラッグします。レポーティング·ソフトウェアは最も一般的なクロマトグラフィー·ソフトウェア·システムを使用してカスタマイズできます。 レポートは、選択した情報を表示するようにプログラムされることができます。我々は現在、ピーク高さを使用していますが、報告書はまた、ピーク面積を使用するようにプログラムされることができます。 システムをシャットダウンするには、シャットダウンの方法（パラメータは表2に記載）を開始、水浴をオフにし、カラムオーブン温度は30℃に達したときに水素と空気タンクを閉じる 9。エタノールデータピークの高さなどをプロット既知の各外部標準エタノール濃度の関数（図2A）。各透析試料によって与えられたピーク高さからエタノール濃度を計算するために、これらの点で与えられる線形関数を使用します。 時間をかけて透析液中のエタノール濃度をプロットすることにより、我々の行動のセッション中に興味のある脳領域におけるエタノール濃度のパターンを見ることができます。以下に示す例のデータ（図2B）は、自己管理セッション中に時間を越えて透析液中のエタノール濃度として表されます。 10。一般的なメンテナンス：ファイバが各500パンク、セプタム100人ごとパンクを変更する必要があります繊維を変更するにはガスクロマトグラフキーパッドの[メニュー]を押し、セレクト8400、enterキーを押し、変更シリンジを選択し、enterキーを押します。オートサンプラは、光ファイバを許可するように、それ自体を配置します（SPMEファイバーアセンブリ、75μmのCarboxen-PDMS、スペルコ分析、BellefoNTE、PA）は削除されます。 繊維を覆うドアを開きます。ロックナットを緩めて、繊維集合体を除去することができるように、ラッチを動かします。繊維集合体を取り出す。緩めて緩め繊維を次にアセンブリ内の繊維を保持し、ナット。 新しいものと古い繊維を交換し、繊維集合体を再構築する。 、オートサンプラのアセンブリーを交換して再ラ​​ッチし、所定の位置にアセンブリをねじ込む。設定が完了したら、キーパッド上の "変更が行われた"キーを押すと、オートサンプラが使用自体準備でしょう。 隔を変更するにはまず、緩めセプタムを覆うキャップを（ハイ一時0.450径ジェネリック馴化セプタム、Varian）をしてから、古いセプタムを取り外します。継手にダウンシート新しいセプタムを。キャップを再ねじ込み、レンチで締めます。繊維は隔壁がパンクされた最初の時間を壊すことはありませんように、その後、穿刺セプタムに注射針を使用しています。 </oL> 11。代表的な結果図1はエタノール規格の3濃度のエタノールと自己管理セッションの終了時に収集されたラットの透析液サンプルの例として、クロマトグラムを示しています。エタノールのピークは、相対的に対称である一貫した保持時間を有しており、雑音比> 10への信号があります。これらの基準を満たしていない場合は、システムの保守が必要なことを意味します。彼らの自己管理セッションの過程（図2B）のエタノール自己投与動物から採取した透析液サンプルのエタノール濃度を計算するために使用され、品質のクロマトグラフィー、正しく準備された基準は、線形標準曲線（図2A R2≥0.99）を生成。 図1の例のクロマトグラム。エタノール標準または透析液サンプルの1マイクロリットルをガスCにロードされましたバイアルをhromatographと文章で説明しているように分析した。 2.5、5.0および10mMエタノール規格から生成されたピークのA）のオーバーレイ。 B）のピークは、自記式エタノールを持つラットから透析液試料から発生した。 図2：図1に示す実験例からのグラフィカルな結果。 A）は、エタノールの検量線。エタノール自己管理セッションの向こう側に透析液のエタノール濃度のB）の時間経過。 ハードウェア パラメーター スタートアップの設定 設定を実行している 一休み設定 8400ブルカー（バリアン）オートサンプラー 注入モード SPME SPME N / A <TR> 溶剤浸透深さ 0パーセント 20パーセント N / A サンプル侵入深さ 20パーセント 20パーセント N / A 吸収時間 0.01分 3分 N / A 脱着時間 19分 1分 N / A クリーンモード溶媒源私私 N / A クリーンモード吸脱着時間 0.01分 0.01分 N / A 水浴（オートサンプラを加熱）* 50℃ 50℃ オフ CP-3800バリアンガスクロマトグラフ インジェクタオーブン </TD> オーブンの電源上の上の上のオーブン温度 250℃ 220℃ 30℃ カラムオーブン 整定時間 0.10分 0.10分 0.10min 温度 65℃ 65℃ 30℃ コラム 移動相流量 8.5ミリリットル/分 8.5ミリリットル/分 N / A カラム圧力 〜6プサイ 〜6プサイ ≥0.1 PSI FID検出器 オーブンの電源上の上の上の温度 220℃ 220℃ 120℃ </tr> エレクトロニクス上の上のオフ時定数ファストファストファスト範囲 11 11 11 オートゼロはいはいはい水素炎イオン化検出システムパラメータを使用して表2。ガスクロマトグラフ。このテーブルには、準備するために使用される3つのプログラムのパラメータ（起動設定）、実行（設定を実行している）を示していますし、システムを維持し使用していない（安静時の設定）にある間。