Microdialysis Ethanol während operante Ethanol Selbstverwaltung und Ethanol Bestimmung durch Gaschromatographie

Ein. Stereotaktische Chirurgie Alle Verfahren folgen NIH Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren und wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee genehmigt. Verwendung eines stereotaktischen Vorrichtung, Long-Evans-Ratten, mit Isofluran haben, mit einer 21-Gauge-Kanüle (zur späteren microdilaysis Sonde Insertion) (Plastics Eins, Roanoke) oberhalb der interessierenden Region des Gehirns implantiert und ein Halteseil gut gehandhabt Bolzen in den Kopf der Bühne (zur Mikrodialyse Geräte unterstützt) gebaut. Überwachen Ratten sorgfältig während und nach der Operation. Stellen Sie sicher, dass alle Tiere mindestens eine Woche von postoperativen Pflege und Genesung erhalten und sind gesund, bevor die folgenden Verfahren. A JoVE Video der stereotaktischen Chirurgie Methode verfügbar ist. 1 2. Operant Ausbildung Nach einer Woche post-chirurgischen Wiederherstellung, werden die Tiere auf den Hebel drücken für 10% Saccharose solutio geschultn in einem Med Associates operante Kammer (MedAssociates, Inc., Vermont, USA) mit einem lickometer, versenkbare Hebel und sipper Rohr (wie zuvor in Howard et al., 2009 beschrieben) ausgestattet. 2 Software von MedAssociates wird verwendet, um alle zu gestalten operante Programme (MedAssociates, Inc., Vermont, USA). Nach ihrer Ausbildung zur Saccharose reagiert, beginnen Ratten auf einem geeigneten Trainingsplan während der Ethanol langsam in die Lösung über mehrere Trinkgelage hinzugefügt wird. Zum Beispiel, unser Labor nutzt derzeit eine 8-tägige Trainingsplan, wo Ethanol in der Lösung die ihren Höhepunkt in einer 10% Ethanol / 10% Saccharose Trinklösung ausgeblendet wird. Kontrolltiere erhalten nur 10% Saccharose oder keine Trinklösung. Die spezifische Art von Anlage zu Operant verwendet werden können stark variieren, aber die allgemeinen Verfahren unten beschrieben Mikrodialyse Probenahme noch durchgeführt werden. 3 3. Pre-Mikrodialyse Verfahren: Tethering <ol> Die Nacht vor dem vorletzten Training (in unserem Beispiel ist dies die 7 th Training) werden die Tiere auf die Leine Feder, die auf die Leine Bolzen legt auf den Kopf der Bühne gewöhnt. Die Feder wird an der Lenk-und-Mikrodialyse Gegengewicht Hebelarm, der sich neben dem Käfig ist mit einem Ring stehen und Klammern aufgehängt, so daß das Tier sich frei bewegen kann in dem Käfig. Tethered Tiere verbringen die Nacht in der operante Zimmer, in ihrem eigenen Käfig mit ad libitum Nahrung und Wasser, um sie in die Tethering gewöhnen Set-up. Am folgenden Tag, rundet die Ratte ihre operante Programm mit der Leine an Ort und Stelle, um das Tier mit dem Gefühl der Leine gewöhnen, während der Erfüllung ihrer Verhaltensstörungen Aufgaben. Montieren das Halteseilelement Vorrichtung an der Wand der Kammer nahe der operante oben nach Aussetzung des Fangbands und schwenkbar über der Mitte des Dachs des operante Kammer zu ermöglichen. All dies ist innerhalb des schalldämpfenden Kammer platziert. After die Sitzung, kehren die Ratte ihren eigenen Käfig in der operante Raum microdiaysis Einführen der Sonde zu erwarten. 4. Pre-Mikrodialyse Verfahren: Die Mikrodialysesonde eingesetzt wird am Tag vor der Mikrodialyse Experiment, nachdem die Ratte hat Verhaltenstraining für den Tag fertig Am Tag vor der Mikrodialyse Experiment wurde nach der Ratte eine operante Sitzung beendet, während tethered, betäuben die Ratte mit Isofluran und entfernen Sie den Verschluss von der Führungskanüle. Langsam (über ~ 5 min) Einfügen einer Mikrodialysesonde, mit künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF), durch das kraniale Führungskanüle in das Gehirn interessierenden Bereich perfundiert. Wir verwenden im Labor konstruierten Sonden und Mikrodialyse Verfahren nach Doyon et al., 2003 und Pettit und Justiz, 1991 modelliert. 3, 4 Mit dem zuvor diskutierten Halteseilelement Vorrichtung um den Zu-und Ableitungen der Sonde über dem Tier zu suspendieren. Drehen Sie den probe Durchfluss bis zu 0,2 ul / min. Wieder einmal verbringt der Ratte in der Nacht in der operante Zimmer. 5. Microdialysis Verfahren: Die Entnahme von Proben während der Selbst-verwaltung Sitzung mit appetitive und consummatory Phasen getrennt Mindestens 2 Stunden, bevor das Experiment beginnt, drehen Sie die Sonde an seine Arbeitsmethoden Durchfluss. Wir verwenden entweder 1,0 oder 2,0 ul / min je nach Hirnregion. Prüfen, ob die Sonde Strömungsrate konsistent ist, und mindestens 90% der eingestellten Strömungsrate unter Verwendung einer Hamilton-Spritze auf das Volumen mit der Zeit zu messen. Dialyse Proben (5 oder 7 min) genommen werden, bevor, während und nach dem operanten Sitzung. Die Sampling-Intervall abhängig von der Gehirnregion, Neurotransmitter analysierenden, Dialysat Konzentration des Analyten, und die Empfindlichkeit der analytischen Chemie Geräte für die Analyse verwendet werden. Die Verhaltens-Phasen sind wie folgt: Baseline: Zu Beginn des Experiments,sammeln Dialyse Proben in das Tier zu Hause Käfig (4 Proben). Transfer: Nach Sammlung Heimkäfig Baseline Proben, übertragen Sie die Ratte auf die operante Kammer. Übertragung der tethered rat erfordert äußerste Sorgfalt, um sicherzustellen, dass die Mikrodialyse Fluidübertragungsstrecke nicht verfangen, und dass die Ratte bleibt ruhig. Unmittelbar nach dem Transfer, aktivieren Sie die operante Programm, wie Sie von der Grundlinie / Transfer Probe auf den ersten wait Probe verändern. Warten: Fortfahren, um Proben zu sammeln, wie die Ratte wartet auf den Hebel, um in die Kammer (3-4 Proben in Abhängigkeit von der Gehirnregion) erstrecken. Getränke: Nach der Hebel dargestellt und gepreßt, eine Flasche Trinklösung (10% sucrose/10% Ethanol oder 10% Saccharose) zur Verfügung gestellt wird der Ratte für etwa 20 Minuten (3-4 Proben). Post-Getränk: Nach Drink Zeit bleibt die Flasche zieht, aber die Ratte in der operante Kammer für etwa 20 Minuten (3-4 Proben). 6. Microdialysis Verfahren: Vorbereitung der Mikrodialyse Probe für Ethanol-Analyse Zwei Proben, bevor die Tiere selbst verabreichen die Ethanol-Lösung und alle Proben nach z. Ethanolkonzentration ausgewertet. Pipette entweder eine 1 oder 2 ul Aliquots aus der Probe von Interesse in ein 2 ml Glasfläschchen. Dann verschließen Sie das Fläschchen mit einem luftdichten Septum (9 mm Red Poly Schraubverschluss, PTFE / Sil Septa, Agilent Technologies). Das Volumen des Ethanol-Analyse Aliquots (1 oder 2 ul) hängt von der gesamten Probenvolumen und dem Probenvolumen für zusätzliche Analysen erforderlich. Wenn die Proben für die spätere neurochemischen Analyse verwendet werden, speichern Sie die Stichprobe entsprechend nach dem Pipettieren das Aliquot für Ethanol Quantifizierung. Zum Beispiel, analysiert unser Labor die Proben für Dopamin. Um dies zu erreichen, stellen die Proben auf Trockeneis während des Experimentsund dann, speichern die Proben bei -80 ° C nach dem Versuch. Wir benutzen 2 ul Aliquots für Ethanol Analyse eines 5 min entnommene Probe mit einer Flussrate von 2,0 ul / min für Sonden in den Nucleus accumbens gelegt. Dies ermöglicht wenigstens 7 ul restlichen für die spätere Analyse von Dopamin durch Hochleistungsflüssigchromatographie mit elektrochemischer Detektion. Für Proben aus dem präfrontalen Kortex, der wesentlich niedriger extrazellulären Dopamin-Konzentrationen hat genommen, verwenden wir eine 1 ul Aliquot für Ethanol Analyse aus einer 7-min Probe unter Verwendung einer Flussrate von 1,0 ul / min. 7. Post-Mikrodialyse Verfahren Nach dem Abschluss des Mikrodialyse Experiment, betäuben die Ratte und entfernen Sie die Sonde. Ersetzen Sie den Obturator, wenn das Tier nicht sofort getötet. Sammle das Gehirn innerhalb von drei Tagen des Experiments. Andernfalls kann Beobachtung der Probe Trakt nicht möglich. Das Gehirn soll ich entfernt werdenn Übereinstimmung mit genehmigten Nutzung von Tieren Protokolle. Wir verwenden Natriumpentobarbital (150 mg / kg, ip) Überdosierung durch kardiale Perfusion mit Kochsalzlösung und anschließend Formalin in Salzlösung gefolgt. Tauchen Gehirn in einem Formalin-Kochsalzlösung für mindestens 12 Stunden vor dem Schneiden. Koronal Abschnitt das Gehirn in 100 um Scheiben schneiden. Stain Scheiben mit Cresylviolett, und untersuchen die korrekte Aufsetzen der Sonde. 5, 6 8. Die Analyse der Proben für die Ethanol-Konzentration Die gesammelten Proben sowie externen Standards (0,3125 – 20 mm Ethanol) sind auf unserer Gaschromatographen mit Flammenionisationsdetektor System laufen. Dieses System von einem Varian CP 3800-Gaschromatograph mit einem Flammenionisationsdetektor besteht, einem Bruker (Varian) 8400 Headspace Autosampler bis 50 ° C erwärmt, und ein HP Innowax Kapillarsäule (30 mx 0,53 mm x 1,0 um dicke Folie), mit Helium als mobile Phase. Chromatogramme werden aufgezeichnet und analysiert mit ChromatogrO S Software wie das Varian Star Chromatography Workstation Software, die speziell diskutiert werden hier. Um das System für Ethanol die Analyse vorzubereiten, heizen den Autosampler Platte mit einem umlaufenden Wasserbad, und öffnen Sie die zwei zusätzlichen Gastanks (Luft und Wasserstoff; Helium wird immer links laufen, um das Wachs Spalte zu erhalten). Notieren Sie sich die Gas-Tank Druck, sowie die Anzahl der Proben, die Sie beabsichtigen, so laufen, dass man Zählung der Anzahl der Zeiten zu halten die Faser und Septum wurden, so dass sie bei Bedarf (Fiber-500-Injektionen können verändert werden verwendet; Septum -100 Punktionen). Initiieren Sie die Start-up-Methode, die das System an Proben (Programm-Parameter in Tabelle 2) laufen vorbereitet. Warten, bis das System berichten, dass es "Ready" ist. Initiieren einer 20-min "verbrennen", die die Faser zur Probenanalyse bereitet, indem man es auf eine hohe Temperatur zu desorbieren einem verunreinigt es absorbiert wird, während im Ruhezustand. Standards werden hergestelltVerdünnen 238 ul 95% Ethanol mit Wasser auf ein Endvolumen von 100 ml mit einem Messkolben in einer chemischen Abzugshaube. Dies erzeugt einen 40 mM ethanolischen Lösung. Wir verwenden eine 1:1 Verdünnungsreihe bis 20, 10 zu erzeugen, 5, 2,5, 1,25, 0,625, 0,3125 mM Standards. Für jede Konzentration der Standard, den gleichen Volumenaliquot, die von den Dialyse-Proben entnommen werden. Pipettieren das Aliquot in eine 2 ml Glasflasche und dann verschließen Sie das Fläschchen mit einem luftdichten Septum. Alle Proben werden in Ethanol den Autosampler erhitzt, bis die gesamte Flüssigkeit verdampft worden ist Aliquot. Wir heizen unsere Proben für ca. 30 min. Dieser Abschnitt beschreibt die Star Workstation Software, die wir verwenden, mit unseren Gaschromatographen. Andere Software kann verwendet werden, aber die Beschreibung unten möglicherweise nicht anwendbar. Um Proben auszuführen, erstellen Sie eine Probe-Liste mit, welche Probe in dem Autosampler Slot ist, und wie oft sollte die Probe punktiert werden. Achten Sie darauf, Weiterleitung der Daten-Dateien auf Ihren ausgewählten facher. Wählen Sie dann die Methode der Wahl für Ihre Proben, und beginnen Sie den Lauf. Wir verwenden die Fahrparametern in Tabelle 2 angegeben. Unsere Dialysat Ethanolprogramm absorbiert die Probe für 3 min und desorbiert in die Helium-Strom, der in dem Wachs Kolonne zuführt, für 1 min. Allerdings können Programme geschrieben, um Ihre spezifischen Bedürfnisse anzupassen. Die getrennten Probenkomponenten in dem Wachs Spalte und dann durch den Flammenionisationsdetektor gehen, wo das Kohlenstoff-enthaltende Verbindungen, wie Ethanol, verbrennen und Freisetzung Ionen. Dies führt zu erhöhten Elektronenfluss von den Melder Anode zur Kathode Schaffung eines Stroms, der an Spannung umgewandelt und aufgezeichnet wird, was zu Chromatogramme wie die unten (Figur 1) dargestellt. Die Veränderung der Spannung ist proportional zu der Menge an Kohlenstoffatomen, die durch den Detektor über time.7 Nachdem das System fertig ausgeführt die Proben müssen, um die Integration der einzelnen Peaks zu überprüfen. Für Star Workstation-Software,Klicken Sie auf den blauen Peak-Symbol in der Symbolleiste. Klicken Sie auf jeden Peak die Farbe und ziehen Sie die Pfeile, um die Grundlinie einzustellen. Re-integrieren jeden Peak, bevor er auf die nächste Gruppe von Peaks. Die Peak-Analyse-Software kann eine allgemeine Chromatographie-Software sein. Für Star Workstation-Software auf dem Batch-Report-Symbol in der Symbolleiste klicken. Ziehen Sie jeden Probe von Ihnen angegebenen Ordner auf den Batch-Report, um die Probe-Berichte zu drucken. Reporting-Software kann mit den meisten gängigen Chromatographie-Software-Systeme angepasst werden. Die Berichte können so programmiert, dass die Informationen Ihrer Wahl zeigen. Wir verwenden derzeit Peakhöhe, aber die Berichte können auch so programmiert, dass Peakfläche verwenden. Um das System herunterzufahren, starten Sie die Shut-down-Methode (Parameter wie in Tabelle 2), schalten Sie das Wasserbad, und schließen Sie die Wasserstoff und Luft Tanks, wenn die Säulenofen Temperatur erreicht 30 ° C. 9. Ethanol Daten Zeichnen Sie die Peakhöhe alseine Funktion jedes bekannten externen Standard Ethanolkonzentration (Abbildung 2A). Verwenden Sie die lineare Funktion durch diese Punkte gegeben, die Ethanol-Konzentration aus der Peakhöhe von jedem Dialysat Probe gegeben zu berechnen. Durch Auftragen der Konzentration von Ethanol im Dialysat im Laufe der Zeit, können wir das Muster der Ethanol-Spiegel im Gehirn region of interest während unseres Verhaltens Sitzung sehen. Beispiel Daten, unten (2B) gezeigt, werden, wenn die Konzentration von Ethanol in dem Dialysat über die Zeit während des Selbsttests Administrationssitzung dargestellt. 10. Allgemeine Wartung: Die Faser alle 500 Punktionen, und das Septum geändert werden sollten alle 100 Punktionen Um die Faser zu ändern Auf dem Gaschromatographen Tastatur drücken Sie Menü, wählen Sie 8400, drücken Sie die Eingabetaste, wählen Sie Ändern Spritze, drücken Sie die Eingabetaste. Der Autosampler positioniert sich damit die Faser (SPME Fiber Assembly, 75 um Carboxen-PDMS, Supelco Analytical, Bellefonte, PA) entfernt werden. Öffnen Sie die Tür für den Faser. Die Überwurfmutter, und bewegen Sie die Verriegelung, damit die Faseranordnung entfernt werden. Nehmen Sie die Faseranordnung aus. Die Mutter, die die Faser in der Versammlung hält, und schrauben dann die Faser. Ersetzen Sie die alte Faser mit einem neuen, und montieren Sie den Faserverbund. Ersetzen Sie die Assembly im Autosampler, wieder Rast-und Aufschrauben der Montage einrastet. Wenn Sie fertig sind, drücken Sie "getan zu ändern" auf der Tastatur und der Autosampler wird bereit sich für den Einsatz. Um das Septum ändern Zuerst schrauben Sie die Schutzkappe von der Nasenscheidewand (Hallo-Temp 0,450 Dia. Generisches Conditioned Septa, Varian) und entfernen Sie dann das alte Septum. Sitz der neuen Septum unten in der Armatur. Re-schrauben Sie die Kappe aufsetzen und mit dem Schraubenschlüssel. Dann verwenden Sie eine Injektionsnadel zu durchstechen das Septum so dass die Faser nicht brechen wird zum ersten Mal das Septum durchstochen wird. </ol> 11. Repräsentative Ergebnisse Abbildung 1 zeigt beispielsweise Chromatogramme für drei Konzentrationen von Ethanol Standards und für eine Ratte Dialysat Probe am Ende des Ethanol Selbstverabreichung Sitzung gesammelt. Ethanol Peaks sollte relativ symmetrisch, über konsistente Retentionszeiten und ein Signal-Rausch-Verhältnis> 10. Die Nichtbeachtung dieser Kriterien erfüllen bedeutet, dass Ihr System Wartung erfordert. Qualität Chromatographie und richtig vorbereitet Standards produzieren eine lineare Standardkurve (R2 ≥ 0,99; 2A), die verwendet werden, um die Ethanolkonzentration von Dialysat-Proben aus Ethanol gesammelt berechnen Selbst-Verwaltung Tieren im Laufe ihrer Selbstverwaltung Sitzung (2B) . Abbildung 1. Beispiel Chromatogramme. Ein Mikroliter von Ethanol Standard oder Dialysat Probe wurde in einem Gas beladen chromatograph Fläschchen und analysiert, wie im Text beschrieben. A) Überlagerung von Peaks von 2,5, 5,0 und 10 mM Ethanol Standards erzeugt. B) Peak von einem Dialysat Probe aus einer Ratte, die selbst verwalteten Ethanol hat generiert. Abbildung 2. Graphical Ergebnisse aus Beispiel Experiment in Abbildung 1 dargestellt. A) Ethanol Standardkurve. B) Zeitlicher Verlauf der Dialysat Ethanolkonzentration in einem Ethanol Selbstverwaltung Sitzung. Hardware Parameter Start-up-Einstellung Laufende Einstellung Resting Einstellung 8400 Bruker (Varian) Autosampler Einspritzmodus Spme Spme n / a <tr> Solvent Eindringtiefe 0% 20% n / a Beispiel Eindringtiefe 20% 20% n / a Absorptionszeit 0,01 min 3 min n / a Desorptionszeit 19 min 1 min n / a Clean-Modus Lösungsmittelquelle Ich Ich n / a Clean-Modus Adsorption und Desorption der Zeit 0,01 min 0,01 min n / a Wasserbad (heizt Autosampler) * 50 ° C 50 ° C Ab CP-3800 Varian Gaschromatograph Injector Backofen </td> Backofen Macht Auf Auf Auf Ofentemperatur 250 ° C 220 ° C 30 ° C Säulenofen Einschwingzeit 0,10 min 0,10 min 0.10min Temperatur 65 ° C 65 ° C 30 ° C Spalte Fließgeschwindigkeit der mobilen Phase 8,5 ml / min 8,5 ml / min n / a Column Druck ~ 6 psi ~ 6 psi ≥ 0,1 psi FID-Detektor Backofen Macht Auf Auf Auf Temperatur 220 ° C 220 ° C 120 ° C </tr> Elektronik Auf Auf Ab Zeitkonstante Schnell Schnell Schnell Reichweite 11 11 11 Autozero Ja Ja Ja Tabelle 2. Gaschromatograph mit Flammenionisationsdetektion Systemparameter. Diese Tabelle zeigt die Parameter für die drei Programme zur Vorbereitung (Start-up-Einstellungen), Laufzeit (Laufzeit-Einstellungen) und Wartung des Systems, während nicht in Gebrauch ist (Ruhe-Einstellungen).