Microdialisi di etanolo durante la determinazione operante auto-amministrazione ed etanolo etanolo mediante gascromatografia

1. Chirurgia stereotassica Tutte le procedure seguite la guida NIH per la cura ed uso di animali da laboratorio e sono stati approvati dalla cura degli animali e del Comitato Istituzionale uso. Utilizzando un apparecchio stereotassico, ben gestito a lungo Evans, ratti anestetizzati con isoflurano, sono impiantati con una cannula da 21 gauge (per un successivo inserimento microdilaysis sonda) (Materie plastiche Uno, Roanoke, VA), al di sopra della regione del cervello di interesse, e un cordoncino bullone è costruito nella fase testa (utilizzato per sostenere apparecchiature microdialisi). Monitorare attentamente ratti durante e dopo l'intervento chirurgico. Assicurarsi che tutti gli animali ricevono almeno una settimana di post-chirurgica cura e di recupero e sono in buona salute prima di iniziare le procedure seguenti. Un video JoVE del metodo chirurgico stereotassico è disponibile. 1 2. Formazione operante Dopo una settimana di post-chirurgica di recupero, gli animali sono addestrati a leva stampa per saccarosio solutio 10%n in una camera di Med Associates operante (MedAssociates, Inc., Vermont, USA) dotato di un lickometer, leva a scomparsa, ed il tubo sipper (come descritto in precedenza in Howard et al., 2009). 2 Software da MedAssociates viene utilizzato per progettare tutti programmi operante (MedAssociates, Inc., Vermont, Stati Uniti d'America). Una volta addestrati a rispondere per il saccarosio, iniziano i ratti in un programma di allenamento adeguato, durante il quale l'etanolo sta gradualmente aggiunto nella soluzione più bevute più. Ad esempio, il nostro laboratorio si avvale attualmente di 8 giorni programma di allenamento in cui è sbiadito etanolo nella soluzione si conclude con un etanolo 10% / 10% di soluzione di saccarosio potabile. Gli animali di controllo ricevono solo il 10% di saccarosio o di nessuna soluzione bere. Il tipo specifico di programma operante da utilizzare può variare ampiamente, ma le procedure generali descritte di seguito per il campionamento microdialisi può ancora essere effettuata. 3 3. Pre-microdialisi Procedura: Tethering <ol> La notte prima della seconda seduta di allenamento precedente (nel nostro esempio questa è la sessione di allenamento 7 °), gli animali sono abituati a legare la molla, che si attacca al perno cavezza dalla loro fase testa. La molla si attacca alla girevole microdialisi e contro braccio di leva di bilanciamento, che è sospeso vicino alla gabbia con uno stand anello e morsetti in modo che l'animale possa muoversi liberamente all'interno della sua gabbia. Animali Tethered passare la notte nella stanza operante, nella loro gabbia casa con cibo ad libitum e acqua, per abituarli al tethering set-up. Il giorno seguente, il ratto completa il suo programma operante con la cavezza in atto, per abituare l'animale al sentimento del legare durante l'esecuzione dei suoi compiti comportamentali. Montare l'apparecchio tethering alla parete della camera operante vicino alla parte superiore per consentire la sospensione del laccio e girevole sopra il centro del tetto della camera di operante. Tutto questo è posto all'interno della camera fonoassorbenti. After la sessione, riportare il topo alla sua gabbia di casa nella sala operante in attesa di inserimento sonda microdiaysis. 4. Pre-microdialisi Procedura: La sonda microdialisi è inserito il giorno prima dell'esperimento microdialisi, dopo il ratto ha completato la formazione comportamentale per il giorno Il giorno prima dell'esperimento microdialisi, dopo il ratto ha completato una sessione operante mentre tethered, anestetizzare il ratto con isoflurano e togliere l'otturatore dalla cannula guida. Lentamente (oltre ~ 5 min) inserire una sonda microdialisi, perfusi con liquido cerebrospinale artificiale (ACSF), attraverso la cannula guida cranica nella regione del cervello di interesse. Usiamo laboratorio costruite le sonde e le procedure di microdialisi modellati Doyon et al., 2003 e Pettit e Giustizia, 1991. 3, 4 Utilizzare l'apparato tethering precedentemente discusso di sospendere l'ingresso e linee di uscita della sonda sopra dell'animale. Ruotare il pveste portata fino a 0,2 microlitri / min. Ancora una volta, il ratto trascorre la notte nella stanza operante. 5. Procedure di microdialisi: Raccolta di campioni durante l'auto-somministrazione sessione con fasi appetitive e consumatorio separati Almeno 2 ore prima che l'esperimento inizia, alzare la sonda alla sua portata di esercizio. Si può usare o 1,0 o 2,0 microlitri / min a seconda della regione del cervello. Verificare che la portata sonda è coerente, e almeno il 90% della quantità regolata di flusso utilizzando una siringa Hamilton da misurare volume nel tempo. Campioni di dialisi (5 o 7 min) sono presi, prima, durante e dopo la sessione operante. L'intervallo di campionamento dipende dalla regione del cervello, neurotrasmettitore analizzato, dializzato concentrazione dell'analita e sensibilità dell'apparecchio chimica analitica da utilizzare per l'analisi. Le fasi comportamentali sono i seguenti: Baseline: All'inizio della sperimentazione,raccogliere campioni di dialisi in gabbia dell'animale domestico (4 campioni). Trasferimento: Dopo la raccolta di campioni di gabbia a casa di base, trasferire il topo alla camera operante. Trasferimento del ratto tethered richiede estrema attenzione per assicurarsi che il fluido linea microdialisi di trasferimento non intricata, e che il topo rimane calmo. Subito dopo il trasferimento, attivare il programma operante come si passa dalla linea di base / trasferimento del campione al campione di attesa prima. Attendere: continuare a raccogliere campioni come il topo attende la leva per estendere nella camera (campioni 3-4 a seconda della regione del cervello). Drink: Dopo la leva viene presentato e premuto, un flacone di soluzione potabile (10% etanolo sucrose/10% o 10% di saccarosio) è reso disponibile per il ratto per circa 20 minuti (campioni 3-4). Post-drink: Dopo il periodo di bevanda, si ritrae bottiglia, ma il ratto i restin la camera operante per circa 20 minuti (campioni 3-4). 6. Procedure di microdialisi: Preparazione del campione per l'analisi microdialisi etanolo Due campioni prima animali auto-somministrare la soluzione di etanolo, e tutti i campioni dopo, vengono valutati per la concentrazione di etanolo. Pipettare un 1 o 2 aliquota microlitri dal campione di interesse in una fiala di vetro 2 ml. Poi chiude la fiala con un setto a tenuta d'aria (9 mm Rosso Poly Vite, PTFE / Sil Setti, Agilent Technologies). Il volume della aliquota analisi etanolo (1 o 2 microlitri) dipende dal volume totale del campione, e il volume di campione necessaria per eventuali ulteriori analisi. Se i campioni saranno utilizzati per una successiva analisi neurochimica, conservare il campione in modo appropriato dopo aver pipettato l'aliquota per la quantificazione etanolo. Ad esempio, il nostro laboratorio analizza i campioni per la dopamina. A tale scopo, posizionare i campioni in ghiaccio secco durante l'esperimentoe quindi, conservare i campioni a -80 ° C dopo l'esperimento. Usiamo aliquote di 2 microlitri per l'analisi di un campione di etanolo 5 min raccolti utilizzando una portata di 2,0 microlitri / min per sonde situate nel nucleo accumbens. Questo permette almeno 7 microlitri rimanente per successiva analisi della dopamina mediante cromatografia liquida ad alta prestazione con rivelazione elettrochimica. Per i campioni prelevati dalla corteccia prefrontale, che ha molto basse concentrazioni di dopamina extracellulare, usiamo una aliquota 1 ml per analisi etanolo preso da un 7-min campione utilizzando un flusso di 1,0 microlitri / min. 7. Post-microdialisi procedure Dopo la conclusione dell'esperimento microdialisi, anestetizzare il ratto e rimuovere la sonda. Sostituire l'otturatore se l'animale non è immediatamente sottoposti ad eutanasia. Raccogliere il cervello entro tre giorni dell'esperimento. Altrimenti, visualizzazione del tratto sonda può non essere possibile. Il cervello deve essere rimosso iconformità con i protocolli n animali approvati in uso. Usiamo sodio pentobarbital (150 mg / kg, ip) sovradosaggio, seguita da perfusione cardiaca con soluzione salina e poi formalina in soluzione salina. Immergere in un cervello in formalina salina soluzione per almeno 12 ore prima del taglio. Coronalmente sezione del cervello in 100 fette micron. Colorare fette con violetto cresolo, ed esaminare per il posizionamento della sonda corretta. 5, 6 8. Analisi di campioni per la concentrazione di etanolo I campioni raccolti e standard esterni (0,3125-20 etanolo mM) sono gestiti dal nostro gascromatografo con sistema di rilevazione a ionizzazione di fiamma. Questo sistema è composto da un Varian CP 3800 gascromatografo con rivelatore a ionizzazione di fiamma, un (Varian) Bruker 8400 headspace autocampionatore riscaldata a 50 ° C, e una colonna HP INNOWax capillare (30 mx 0,53 millimetri x 1,0 pellicola micron di spessore), con elio come fase mobile. Cromatogrammi sono registrati e analizzati con Chromatogrsoftware aphy come la workstation Varian Stella software cromatografia che verranno specificamente discusso qui. Per preparare il sistema per l'analisi etanolo, riscaldare la piastra autocampionatore con un bagno di acqua di ricircolo, e aprire i due serbatoi supplementari (aria e idrogeno, l'elio è sempre lasciato in esecuzione per mantenere la colonna cera). Registrare le pressioni del gas del serbatoio, così come il numero di campioni che si intende eseguire in modo da poter tenere il conto del numero di volte che la fibra e setto sono stati utilizzati in modo che possano essere modificati, se del caso (fibre-500 iniezioni setto; forature -100). Avviare lo start-up metodo, che prepara il sistema per eseguire i campioni (i parametri del programma di cui alla tabella 2). Attendere che il sistema di segnalare che si tratta di "Pronto". Avviare un 20-minuti "bruciare", che prepara la fibra per l'analisi del campione sottoponendolo a una temperatura elevata per desorbire qualsiasi contamina ha assorbito a riposo. Gli standard sono fatti dadiluendo 238 ml di etanolo al 95% con acqua ad un volume finale di 100 mL utilizzando un pallone volumetrico in una cappa. Questo crea una soluzione di etanolo al 40 mM. Usiamo una diluizione 1:1 di serie per creare 20, 10, 5, 2.5, 1.25, 0.625, 0,3125 mm Standard. Per ogni concentrazione dello standard, utilizzare le stesse aliquote volume che verranno prese dai campioni dialisi. Pipettare l'aliquota in un flacone di vetro da 2 ml, e quindi sigillare il flaconcino con un setto a tenuta d'aria. Tutti i campioni di etanolo vengono riscaldati nel campionatore automatico fino a quando il liquido aliquota intera è stato vaporizzato. Abbiamo riscaldare i nostri campioni per circa 30 min. Questa sezione descrive il software Workstation stella che usiamo con il nostro gascromatografo. Altro software può essere utilizzato, ma la descrizione sottostante non può essere applicabile. Per eseguire i campioni, creare una lista di esempio notando che campione è in quale slot autocampionatore, e quante volte il campione deve essere forato. Assicurarsi che il percorso dei file di dati al vostro volte selezionatoer. Quindi, selezionare il metodo di scelta per i campioni, e iniziare la corsa. Usiamo i parametri di funzionamento indicato in tabella 2. Nostro programma etanolo dializzato assorbe il campione per 3 min e desorbe nel flusso di elio, che alimenta la colonna cera, per 1 min. Tuttavia, i programmi possono essere scritti per soddisfare le vostre esigenze specifiche. I componenti del campione distinti nella colonna di cera, e poi passare attraverso il rivelatore a ionizzazione di fiamma dove il carbonio contenenti composti, come gli ioni etanolo, combust e rilascio. Ciò si traduce in un aumento del flusso di elettroni da anodo del rivelatore al catodo creando una corrente, che viene convertita in tensione e registrata conseguente cromatogrammi come quella mostrata di seguito (Figura 1). La variazione di tensione è proporzionale alla quantità di carbonio che passa attraverso il rivelatore attraverso time.7 Dopo che il sistema è terminata l'esecuzione degli esempi è necessario verificare l'integrazione di ogni picco. Per il software Workstation Star,fare clic sull'icona di picco blu nella barra degli strumenti. Fare clic sul colore di ogni picco e trascinare le frecce per regolare la linea di base. Reintegrare ogni picco prima di spostarsi al prossimo gruppo di cime. Il software di analisi di picco può essere qualsiasi software cromatografia generale. Per il software Workstation Star, fare clic sull'icona del lotto relazione nella barra degli strumenti. Trascinare ogni campione dalla cartella specificata al report in batch per stampare i report di esempio. Software di reporting possono essere personalizzati con sistemi di cromatografia più diffusi software. I report possono essere programmati per mostrare le informazioni di vostra scelta. Al momento stiamo utilizzando altezza del picco, ma i rapporti possono anche essere programmati per utilizzare l'area di picco. Per spegnere il sistema, avviare il shut-down metodo (parametri indicato in tabella 2), spegnere il bagno d'acqua, e chiudere i serbatoi di idrogeno e aria quando la temperatura del forno a colonna raggiunge i 30 ° C. 9. Etanolo dati Tracciare l'altezza del piccouna funzione di ogni concentrazione nota esterno etanolo standard (Figura 2A). Utilizzare la funzione lineare dato da questi punti per calcolare la concentrazione di etanolo dalla altezza del picco in ciascun campione dializzato. Riportando la concentrazione di etanolo nel dializzato nel tempo, si può vedere lo schema di livelli di etanolo nella regione del cervello di interesse durante la seduta comportamentale. Dati di esempio, mostrato sotto (Figura 2B), sono rappresentati come la concentrazione di etanolo nel dializzato nel tempo durante la sessione di autosomministrazione. 10. Manutenzione generale: La fibra deve essere cambiato ogni 500 punture, e il setto ogni 100 forature Per cambiare la fibra Nel menu gascromatografo tastiera numerica premere, selezionare 8400, premere Invio, selezionare siringa cambiamento, premere invio. Il campionatore automatico si posizionerà per consentire la fibra (Assemblea Fibra SPME, 75 micron Carboxen-PDMS, Supelco analitica, Bellefonte, PA) da rimuovere. Aprire lo sportello che copre la fibra. Svitare il dado di bloccaggio e spostare il fermo per permettere il montaggio delle fibre da rimuovere. Prendete il gruppo fibra fuori. Svitare il dado che tiene la fibra in assemblea, e poi svitare la fibra. Sostituire la fibra vecchio con uno nuovo, e rimontare il gruppo di fibre. Sostituire il gruppo nel campionatore automatico, ri-aggancio e avvitare il gruppo in posizione. Al termine, premere il tasto "cambia fatto" sulla tastiera, e il campionatore automatico sarà pronto per l'uso stesso. Per cambiare il setto In primo luogo, svitare il tappo che copre il setto (Hi-Temp 0,450 Dia. Generico condizionata Septa, Varian) e quindi rimuovere il setto vecchio. Sede del setto nuovo giù nel raccordo. Riavvitare il tappo e serrare con la chiave. Quindi, utilizzare un ago di iniezione per forare il setto in modo che la fibra non rompere la prima volta viene perforato il setto. </ol> 11. Risultati rappresentativi La figura 1 mostra cromatogrammi di esempio per tre concentrazioni di etanolo e standard per un campione dializzato ratto raccolta alla fine della sessione di etanolo autosomministrazione. Picchi etanolo dovrebbe essere relativamente simmetriche, hanno tempi di ritenzione costanti, e un rapporto segnale-rumore> 10. Il mancato rispetto di questi criteri significa che il sistema necessita di manutenzione. Cromatografia standard di qualità e correttamente preparate produrre una curva standard lineare (R2 ≥ 0,99; Figura 2A) che viene utilizzato per calcolare la concentrazione di etanolo dialisato campioni raccolti da auto-somministrazione di etanolo gli animali nel corso della loro auto-somministrazione di sessione (Figura 2B) . Figura 1. Cromatogrammi di esempio. Un microlitro di standard di etanolo o campione dializzato è stato caricato in un gas chromatograph flaconcino e analizzati come descritto nel testo. A) Sovrapposizione dei picchi generati da 2.5, 5.0 e 10 Norme di etanolo mM. B) di picco generato da un campione dializzato da un ratto che ha auto-somministrato etanolo. Figura 2. Risultati grafici di esperimento di esempio illustrato nella Figura 1. A) Etanolo curva standard. B) Naturalmente il tempo di concentrazione di etanolo dialisato attraverso una sessione di auto-somministrazione di etanolo. Hardware Parametro Start-up di impostazione Esecuzione di impostazione Impostazione di riposo 8400 Bruker (Varian) Autocampionatore Modalità di iniezione SPME SPME n / a <tr> Profondità di penetrazione del solvente 0% 20% n / a Esempio di penetrazione in profondità 20% 20% n / a Assorbimento tempo 0,01 min 3 min n / a Desorbimento tempo 19 min 1 min n / a Pulire fonte solvente modalità Io Io n / a Clean modalità di adsorbimento e desorbimento tempo 0,01 min 0,01 min n / a Bagnomaria (riscalda autocampionatore) * 50 ° C 50 ° C Spento CP-3800 Varian gascromatografo Iniettore Forno </td> Potenza forno Su Su Su Temperatura del forno 250 ° C 220 ° C 30 ° C Colonna Forno Tempo di stabilizzazione 0,10 min 0,10 min 0.10min Temperatura 65 ° C 65 ° C 30 ° C Colonna Fase mobile portata 8,5 ml / min 8,5 ml / min n / a Colonna di pressione ~ 6 psi ~ 6 psi ≥ 0,1 psi Rivelatore FID Potenza forno Su Su Su Temperatura 220 ° C 220 ° C 120 ° C </tr> Elettronica Su Su Spento Costante di tempo Veloce Veloce Veloce Gamma 11 11 11 Autozero Sì Sì Sì Tabella 2. Gascromatografo con parametri di rilevazione di fiamma a ionizzazione di sistema. Questa tabella mostra i parametri per i tre programmi utilizzati per la preparazione (start-up delle impostazioni), di esecuzione (esecuzione impostazioni) e la manutenzione del sistema, mentre non è in uso (le impostazioni di riposo).