Microdiálise de etanol durante a operante determinação auto-administração de etanol e etanol por cromatografia gasosa

1. Cirurgia estereotáxica Todos os procedimentos siga o Guia NIH para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e foram aprovados pelo Animal Care Institucional e Comitê de uso. Utilizando um aparelho de estereotaxia, bem tratados ratos Long-Evans, anestesiados com isoflurano, foram implantados com uma cânula de calibre 21 (para posterior inserção da sonda microdilaysis) (Plastics One, Roanoke, VA) acima da região do cérebro de interesse, e um tirante parafuso é construído na fase cabeça (utilizada para suportar equipamentos de microdiálise). Monitorar cuidadosamente ratos durante e após a cirurgia. Certifique-se que todos os animais recebem pelo menos uma semana de pós-cirúrgico e recuperação e são saudáveis, antes de iniciar os procedimentos a seguir. Um vídeo JoVE do método de cirurgia estereotáxica está disponível. 1 2. Formação operante Após uma semana de recuperação pós-cirúrgica, os animais são treinados para alavanca de imprensa para 10% de sacarose solution em uma câmara Med Associates operante (MedAssociates, Inc., Vermont, EUA), equipado com um lickometer, alavanca retráctil, e tubo sipper (tal como anteriormente descrito em Howard et al., 2009). 2 Software de MedAssociates é utilizada para desenhar todo programas operante (MedAssociates, Inc., Vermont, EUA). Uma vez formado para responder a sacarose, começam ratos num programa de treino adequado, durante o qual o etanol é adicionado gradualmente à solução ao longo de sessões múltiplas beber. Por exemplo, o nosso laboratório atualmente usa um programa de treinamento de 8 dias onde o etanol está desbotada na solução culminando em um 10% de etanol / solução de beber 10% de sacarose. Animais controle só recebem 10% de sacarose ou nenhuma solução de beber. O tipo específico de programação operante a ser utilizada pode variar amplamente, mas os procedimentos gerais descritos abaixo para a amostragem de microdiálise ainda podem ser realizadas. 3 3. Pré-microdiálise Procedimentos: Tethering <ol> A noite antes da segunda para última sessão de treino (no nosso exemplo é a sessão de treinamento 7 º), os animais estão habituados a primavera corda, que atribui ao parafuso corda do seu estágio de cabeça. A mola prende à peça giratória do braço de alavanca de microdiálise e contrapeso, o qual é suspenso ao lado da gaiola com um suporte de anel e grampos de modo que o animal possa movimentar-se livremente dentro da sua gaiola. Animais amarrados passar a noite na sala de operante, em sua gaiola para casa com comida à vontade anúncio e água, para habituá-los ao tethering set-up. No dia seguinte, o rato completa seu programa operante com a corda no lugar, para habituar o animal a sensação da corda durante a execução de suas tarefas comportamentais. Montar o aparelho de amarrar à parede da câmara operante perto da parte superior para permitir que a suspensão da corda e giratório acima do centro do tecto da câmara operante. Tudo isso é colocado dentro da câmara de som atenuante. After a sessão, devolver o rato à sua gaiola na sala operante para aguardar microdiaysis inserção da sonda. 4. Pré-microdiálise Procedimentos: A sonda de microdiálise é inserido no dia antes da experiência de microdiálise, após o rato tenha completado a formação comportamental para o dia O dia antes da experiência de microdiálise, após o rato foi concluída uma sessão operante enquanto amarrado, anestesiar o rato com isoflurano e remover o obturador da cânula guia. Lentamente (durante ~ 5 min) inserir uma sonda de microdiálise, perfundidos com fluido espinhal cerebral artificial (ACSF), através da cânula guia craniana para a região do cérebro de interesse. Usamos laboratório construídas sondas e procedimentos de microdiálise modelado após Doyon et al., 2003 e Pettit e Justiça, 1991. 3, 4 Utilizar o aparelho de tethering previamente discutido para suspender linhas de entrada e de saída da sonda acima do animal. Vire o ptaxa de fluxo de robe até 0,2 ul / min. Mais uma vez, o rato gasta a noite no quarto operante. 5. Procedimentos de microdiálise: Coleção de amostras durante o auto-administração sessão com fases apetitivas ea consumação separados Pelo menos 2 horas antes da experiência começar, transformar-se a sonda para o seu fluxo de trabalho. Usamos ou 1,0 ou 2,0 ul / min, dependendo da região do cérebro. Verificar que a taxa de fluxo da sonda é consistente, e, pelo menos, 90% do caudal regulado por meio de uma seringa de Hamilton para medir o volume ao longo do tempo. Amostras de diálise (5 ou 7 min) são tomadas antes, durante e após a sessão operante. O intervalo de amostragem de acordo com a região do cérebro, neurotransmissor a ser analisado, o dialisado concentração do analito, e a sensibilidade do equipamento de química analítica a ser utilizado para a análise. As fases comportamentais são os seguintes: Linha de base: No início do experimento,coletar amostras de diálise na jaula do animal em casa (4 amostras). Transferência: Após a coleta de amostras de origem da linha de base da gaiola, transferir o rato para a câmara operante. Transferência do rato tethered requer muito cuidado para assegurar que a linha de transferência de fluido de microdiálise não se torne emaranhada, e que o rato permanece calmo. Imediatamente após a transferência, ativar o programa operante como você mudar a partir da amostra de base / transferência para a amostra espera primeiro. Espera: Continuar a recolher amostras, tal como o rato aguarda a alavanca para estender para dentro da câmara (amostras 3-4, dependendo da região do cérebro). Bebida: Depois que a alavanca é apresentada e pressionado, uma garrafa de solução de beber (10% de etanol sucrose/10% ou 10% de sacarose) é disponibilizada para o rato de cerca de 20 minutos (amostras 3-4). Pós-bebida: Após o período de bebida, as garrafas se retrai, mas o rato continua in da câmara operante por cerca de 20 minutos (amostras 3-4). 6. Procedimentos de microdiálise: Preparação de amostra de microdiálise para análise de etanol Duas amostras antes de os animais a auto-administrar a solução de etanol, e depois de todas as amostras, são avaliados quanto à concentração de etanol. Pipeta ou uma alíquota de 1 ou 2 uL da amostra de interesse para um frasco de vidro de 2 ml. Em seguida, selar o frasco com um septo de ar comprimido (9 mm Vermelho Poly Parafuso, PTFE / Sil septos, a Agilent Technologies). O volume da alíquota análise etanol (1 ou 2 uL), depende do volume total da amostra, e o volume de amostra necessário para quaisquer análises adicionais. Se as amostras serão utilizadas para análise posterior neuroquímicos, armazenar a amostra de forma adequada após a pipetagem da alíquota para a quantificação de etanol. Por exemplo, o nosso laboratório analisa as amostras para a dopamina. Para conseguir isso, colocar as amostras em gelo seco durante o experimentoe, em seguida, armazenar as amostras à temperatura de -80 ° C após a experiência. Usamos alíquotas de 2 ul de etanol para análise de uma amostra de 5 min obtidos utilizando uma taxa de fluxo de 2,0 ul / min para sondas colocadas no núcleo accumbens. Isto permite que, pelo menos, 7 uL restante para análise posterior de dopamina através de cromatografia líquida de alta eficiência com detecção electroquímica. Para amostras colhidas a partir do córtex pré-frontal, que tem muito mais baixas concentrações de dopamina extracelular, utilizamos uma alíquota de 1 ul de etanol para análise de uma amostra tomada a partir de 7 min, utilizando uma taxa de fluxo de 1,0 ul / min. 7. Pós-procedimentos de microdiálise Após a conclusão da experiência de microdiálise, anestesiar ratos e remove a sonda. Substituir o obturador se o animal não está imediatamente sacrificados. Recolher o cérebro dentro de três dias do experimento. Caso contrário, a visualização do trato sonda pode não ser possível. O cérebro deve ser removido in acordo com os protocolos de uso aprovados animais. Usamos pentobarbital de sódio (150 mg / kg, ip) sobredosagem, seguida de perfusão cardíaca com solução salina e em seguida formalina em soro fisiológico. Submerge cérebro em solução de formalina salina durante pelo menos 12 horas antes do seccionamento. Coronariamente seção do cérebro em 100 fatias jam. Mancha fatias com cresil violeta, e examinar para colocação da sonda correta. 5, 6 8. A análise de amostras de concentração de etanol As amostras coletadas, bem como padrões externos (0,3125-20 etanol mM) são executados em nosso cromatógrafo a gás com chama sistema de detecção de ionização. Este sistema é composto por um cromatógrafo de gás Varian CP 3800 com um detector de ionização de chama, um Bruker (Varian) 8400 headspace autosampler à temperatura de 50 ° C, e uma coluna HP Innowax capilar (30 mx 0,53 mm x 1,0 uM película de espessura), com hélio como fase móvel. Cromatogramas são registadas e analisadas com Chromatogrsoftware aphy, tais como o software Varian Workstation Estrela Cromatografia que será discutido especificamente aqui. Para preparar o sistema para análise de etanol, aquecer a placa de auto-amostrador utilizando um banho de água com recirculação, e abrir os dois tanques adicionais de gás (ar e hidrogénio; hélio é sempre deixado correr para preservar a coluna de cera). Gravar as pressões de gás do tanque, bem como o número de amostras que pretende executar, de modo que é possível manter a contagem do número de vezes que a fibra e do septo foram usados ​​de modo a que possam ser mudados quando for apropriado (fibra de 500 injecções; septo punções -100). Iniciar o método de arranque, que prepara o sistema para executar amostras (parâmetros do programa da Tabela 2). Aguarde até que o sistema de comunicação de que se trata de "Pronto". Iniciar um 20-min "queimar", que se prepara a fibra para a análise da amostra, submetendo-a a uma temperatura elevada para desabsorver qualquer contamina de absorvida quando em repouso. Os padrões são feitas pordiluindo 238 ul de etanol a 95% com água até um volume final de 100 mL utilizando um balão volumétrico de um capuz química fumos. Isto cria uma solução de etanol a 40 mM. Nós usamos uma diluição de 1:01 de série para criar 20, 10, 5, 2,5, 1,25, 0,625, 0,3125 mM padrões. Para cada uma das concentrações de padrão, utilize a alíquota mesmo volume que será tomada a partir das amostras de diálise. Pipetar a alíquota para um frasco de vidro de 2 ml, e depois selar o frasco com um septo estanque ao ar. Todas as amostras de etanol são aquecidos no amostrador automático até que a alíquota líquida total foi vaporizado. Nós aquecer as nossas amostras para cerca de 30 min. Esta seção descreve o software Workstation Star, que usamos com nossos cromatógrafo a gás. Outro software pode ser utilizado, mas a descrição abaixo podem não ser aplicáveis. Para executar amostras, criar uma lista de amostras notar que a amostra está em que slot amostrador automático, e quantas vezes a amostra deve ser perfurado. Certifique-se de encaminhar os arquivos de dados para o seu rebanho selecionadoer. Em seguida, selecione o método de escolha para as suas amostras, e começar a correr. Usamos os parâmetros de funcionamento referido na Tabela 2. O nosso programa de etanol dialisado absorve a amostra durante 3 minutos e é dessorvido para a corrente de hélio, que alimenta a coluna de cera, durante 1 min. No entanto, os programas podem ser escritos para acomodar as suas necessidades específicas. Os componentes da amostra separados na coluna de cera, e depois passar pelo detector de ionização de chama, onde o carbono que contém compostos, como os íons de combustão de etanol, e solte. Isto resulta em fluxo de electrões do ânodo aumento do detector para o cátodo, criando uma corrente, a qual é convertida em tensão e gravadas, resultando em cromatogramas, como o mostrado abaixo (Figura 1). A mudança de tensão é proporcional à quantidade de carbono que passa através do detector através tempo.7 Depois que o sistema estiver concluído executar os exemplos que você terá que verificar a integração de cada pico. Para Star software Workstation,clique no ícone de pico azul na barra de ferramentas. Clique na cor de cada pico e arraste as setas para ajustar a linha de base. Reintegrar cada pico antes de passar para o próximo grupo de picos. O software de análise de pico pode ser de qualquer software cromatografia em geral. Para Star software Workstation, clique no ícone do relatório de lote em sua barra de ferramentas. Arraste cada amostra a partir da pasta especificada para o relatório de lote para imprimir os relatórios de exemplo. Software de relatórios podem ser personalizados com sistemas de software mais comuns de cromatografia. Os relatórios podem ser programados para mostrar as informações de sua escolha. Atualmente usamos altura do pico, mas os relatórios também pode ser programado para utilizar a área de pico. Para desligar o sistema, iniciar o método de desligamento (parâmetros observado na Tabela 2), desligue o banho-maria, e fechar os tanques de hidrogênio e ar, quando a temperatura do forno da coluna atinge 30 ° C. 9. Dados de etanol Traçar a altura de pico comouma função de cada concentração de etanol conhecida de padrão externo (Figura 2A). Utilize a função linear dada por estes pontos para calcular a concentração de etanol a partir da altura do pico dada por cada amostra de dialisado. Traçando a concentração de etanol no dialisado ao longo do tempo, pode-se ver o padrão de níveis de etanol na região cerebral de interesse durante a nossa sessão comportamental. Exemplo de dados, mostrados abaixo (Figura 2B), são representados como a concentração de etanol no dialisado ao longo do tempo durante a sessão de auto-administração. 10. Manutenção Geral: A fibra deve ser trocado a cada 500 punções, e no septo cada 100 furos Para alterar a fibra Na tecla de menu cromatógrafo a gás almofada imprensa, selecione 8400, pressione enter, selecionar seringa mudança, pressione enter. O amostrador automático vai posicionar-se para permitir que a fibra (SPME conjunto de fibras, 75 uM Carboxen-PDMS, Supelco Analytical, Bellefonte, PA) a ser removido. Abra a porta que cobre a fibra. Porca desapertar o bloqueio, e mover a trava para permitir que o conjunto de fibra a ser removido. Pegue o conjunto de fibra fora. Desapertar a porca que prende a fibra na montagem, e depois desapertar a fibra. Substituir a fibra antigo por um novo, e remontar o conjunto de fibra. Substitua o conjunto do amostrador automático, re-travamento e parafusar o conjunto no lugar. Quando você terminar, pressione "mudar feito" no teclado, eo amostrador automático estará pronto para uso próprio. Para alterar o septo Primeiro, retire a tampa que cobre o septo (Hi-Temp Dia 0,450. Genéricos Septa condicionado, Varian) e depois remover o septo de idade. Banco do septo novo para dentro do encaixe. Re-aperte a tampa e aperte-o com a chave. Em seguida, utilizar uma agulha de injecção de modo a perfurar o septo de modo a que a fibra não irá romper a primeira vez que o septo é puncionada. </ol> 11. Resultados representativos A Figura 1 mostra cromatogramas de exemplo para três concentrações de etanol e de padrões para obter uma amostra de dialisado de rato recolhidos no final do etanol sessão de auto-administração. Picos de etanol deve ser relativamente simétrica, têm tempos de retenção consistente, e uma relação sinal-ruído> 10. O não cumprimento destes critérios significa que seu sistema requer manutenção. Cromatografia de padrões de qualidade e correctamente preparados produzir uma curva padrão linear (R2 ≥ 0,99; Figura 2A) que é usado para calcular a concentração de etanol de amostras de dialisado recolhido a partir de etanol a auto-administração de animais ao longo do curso da sua sessão de auto-administração (Figura 2B) . Figura cromatogramas 1. Exemplo. Um microlitro de padrão ou amostra de etanol dialisado foi carregado para um c de gáshromatograph frasco e analisadas como descrito no texto. A) de sobreposição dos picos gerados a partir de 2,5, 5,0 e 10 mM de padrões de etanol. B) pico gerada a partir de uma amostra de dialisado de um rato que tem a auto-administração de etanol. Figura 2. Resultados gráficos de experimento exemplo mostrado na Figura 1. A) curva padrão de Etanol. B) Evolução temporal da concentração de etanol através de um dialisado etanol sessão de auto-administração. Ferragens Parâmetro Start-up definição Correndo definição Configuração de descanso 8400 Bruker (Varian) Autosampler Modo de injeção SPME SPME n / a <tr> Profundidade de penetração de solvente 0% 20% n / a Profundidade de penetração da amostra 20% 20% n / a Tempo de absorção 0,01 min 3 min n / a Tempo de dessorção 19 min 1 min n / a Limpe fonte modo de solvente Eu Eu n / a Limpo modo adsorção e dessorção de tempo 0,01 min 0,01 min n / a Banho de água (aquece amostrador automático) * 50 ° C 50 ° C Fora CP-3800 Cromatógrafo de Gás Varian Forno Injector </td> Potência do forno Em Em Em A temperatura do forno 250 ° C 220 ° C 30 ° C Forno de coluna Tempo de estabilização 0,10 min 0,10 min 0.10min Temperatura 65 ° C 65 ° C 30 ° C Coluna Vazão da fase móvel 8,5 ml / min 8,5 ml / min n / a Pressão coluna ~ 6 psi ~ 6 psi ≥ 0,1 psi FID detector Potência do forno Em Em Em Temperatura 220 ° C 220 ° C 120 ° C </tr> Eletrônica Em Em Fora Constante de tempo Rápido Rápido Rápido Alcance 11 11 11 Autozero Sim Sim Sim Tabela 2. Cromatógrafo a gás com chama de ionização parâmetros do sistema de detecção. Esta tabela mostra os parâmetros para os três programas usados ​​para preparar (start-up configurações), execute (executando as configurações) e manter o sistema quando não estiver em uso (configurações de repouso).