Microdiálisis de etanol durante etanol operante determinación y la auto-administración de etanol por cromatografía de gases

1. La cirugía estereotáxica Todos los procedimientos de seguimiento de la Guía del NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y fueron aprobados por el Cuidado de Animales institucional y el empleo Comisión. El uso de un aparato estereotáxico, bien manejada ratas Long-Evans, anestesiados con isoflurano, se implantan con una cánula de calibre 21 (para más tarde microdilaysis inserción de la sonda) (Plastics One, Roanoke, VA) por encima de la región cerebral de interés, y una cinta de sujeción cerrojo está integrado en la etapa de cabeza (utilizado para soportar equipo de microdiálisis). Controlar las ratas cuidadosamente durante y después de la cirugía. Asegúrese de que todos los animales reciben por lo menos una semana de atención postquirúrgica y la recuperación y están sanos antes de iniciar el siguiente procedimiento. Un video JoVE del método de la cirugía estereotáxica está disponible. 1 2. Formación operante Después de una semana de recuperación post-quirúrgica, los animales son entrenados para palanca de prensa de sacarosa 10% solution en una cámara Med Associates operante (MedAssociates, Inc., Vermont, EE.UU.) equipado con un lickometer, palanca retráctil, y el tubo para sorber (como se ha descrito previamente en Howard et al., 2009). 2 Software de MedAssociates se utiliza para diseñar todo programas operantes (MedAssociates, Inc., Vermont, EE.UU.). Una vez entrenados para responder a la sacarosa, comienzan las ratas en un programa de entrenamiento adecuado durante el cual el etanol se añade gradualmente a la solución durante varias sesiones de bebida. Por ejemplo, nuestro laboratorio actualmente utiliza un programa de entrenamiento de 8-día donde el etanol se desvaneció en la solución que culmina en un 10% de etanol / 10% de solución de sacarosa potable. Los animales de control sólo reciben el 10% de sacarosa o ninguna solución bebible. El tipo específico de horario operante para ser usada puede variar ampliamente, pero los procedimientos generales descritos a continuación para la toma de muestras de microdiálisis aún puede llevarse a cabo. 3 3. Microdiálisis Procedimientos previos: Tethering <ol> La noche antes de la segunda a la última sesión de entrenamiento (en nuestro ejemplo se trata de la sesión de entrenamiento 7 º), los animales se habitúan a la primavera de sujeción, que se inserta en el tornillo de sujeción en su etapa cabeza. El resorte se une a la pieza giratoria de microdiálisis y brazo de contra balanza de palanca, que está suspendido al lado de la jaula con un soporte de anillo y abrazaderas para que el animal pueda moverse libremente dentro de su jaula. Animales atados pasar la noche en la habitación operante, en su jaula con comida y agua ad libitum, para habituarse a la inmovilización puesta a punto. El día siguiente, la rata completa su programa operante con la correa de sujeción en su lugar, a habituar al animal a la sensación de la correa de sujeción mientras que realiza sus tareas de comportamiento. Montar el aparato de anclaje a la pared de la cámara operante cerca de la parte superior para permitir la suspensión de la correa de sujeción y giratorio sobre el centro del techo de la cámara operante. Todo esto se coloca dentro de la cámara de atenuación de sonido. After la sesión, vuelva a la rata a su jaula en la sala operante a la espera de inserción microdiaysis sonda. 4. Microdiálisis Pre-Procedimiento: La sonda de microdiálisis se introduce el día antes del experimento de microdiálisis, después de la rata ha completado la formación del comportamiento para el día El día antes del experimento de microdiálisis, después de que la rata ha completado una sesión operante mientras atado, anestesiar la rata con isoflurano y se retire el obturador de la cánula guía. Lentamente (durante ~ 5 min) insertar una sonda de microdiálisis, perfundidos con líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF), a través de la cánula guía craneal en la región del cerebro de interés. Utilizamos laboratorios construidos por las sondas de microdiálisis y procedimientos siguiendo el modelo de Doyon et al., 2003 y Pettit y Justicia, 1991. 3, 4 Utilizar el aparato de inmovilización previamente discutido para suspender la entrada y la de salida de la sonda por encima del animal. Gire el ptúnica caudal hasta 0,2 l / min. Una vez más, la rata pasa la noche en la sala operante. 5. Procedimientos de microdiálisis: Colección de muestras durante el período de auto-administración con fases apetitiva y consumatoria separados Por lo menos 2 horas antes de comenzar el experimento, suba la sonda a su tasa de flujo de trabajo. Usamos ya sea 1,0 o 2,0 l / min dependiendo de la región del cerebro. Comprobar que el caudal de la sonda es constante, y por lo menos 90% del caudal establecido mediante el uso de una jeringa de Hamilton para medir el volumen con el tiempo. Muestras de diálisis (5 min o 7) se toman antes, durante y después de la sesión operante. El intervalo de muestreo depende de la región del cerebro, neurotransmisor que se analiza, el dializado concentración del analito, y la sensibilidad del equipo de química analítica para ser utilizado para el análisis. Las fases de comportamiento son los siguientes: Línea de base: Al inicio del experimento,recoger muestras de diálisis en la jaula hogar del animal (4 muestras). Transferencia: Después de la recogida de muestras de origen de línea de base jaula, traslado a la rata a la cámara operante. Transferencia de la rata anclada requiere extremo cuidado para asegurarse de que el fluido de microdiálisis línea de transferencia no se enrede, y que la rata se mantiene en calma. Inmediatamente después de la transferencia, activar el programa operante a medida que cambia de la muestra de referencia / transferencia a la espera de la muestra en primer lugar. Esperar: Continuar para recoger muestras como la rata espera a la palanca para extenderse dentro de la cámara (muestras 3-4, dependiendo de la región del cerebro). Beber: Después de la palanca se presenta y se presiona, una botella de solución potable (10% sucrose/10% etanol o 10% de sacarosa) se pone a disposición de la rata durante alrededor de 20 minutos (muestras 3-4). Post-bebida: Después del período de la bebida, se retrae la botella, pero los restos de ratas in la cámara operante durante unos 20 minutos (muestras 3-4). 6. Procedimientos de microdiálisis: Preparación de la muestra para el análisis de microdiálisis etanol Dos muestras de animales antes de la auto-administración de la solución de etanol, y todas las muestras después, se evalúan para la concentración de etanol. Pipetear ya sea una alícuota de 1 o 2 l de la muestra de interés en un vial de vidrio de 2 ml. A continuación, sellar el vial con un tabique hermético (9 mm Red Poly tapón de rosca, PTFE / Sil Septa, Agilent Technologies). El volumen de la alícuota análisis etanol (1 l o 2) depende del volumen total de la muestra, y el volumen de muestra requerido para los análisis adicionales. Si las muestras se usarán para su posterior análisis neuroquímico, almacenar la muestra apropiadamente después de pipetear la alícuota para la cuantificación de etanol. Por ejemplo, nuestro laboratorio analiza las muestras para la dopamina. Para lograr esto, colocar las muestras en hielo seco durante el experimentoy, a continuación, almacenar las muestras a -80 ° C después del experimento. Nosotros utilizamos 2 ml de alícuotas para el análisis de una muestra de etanol min 5 recogieron usando un caudal de 2,0 l / min para las sondas colocadas en el núcleo accumbens. Esto permite por lo menos 7 l restante para el análisis posterior de la dopamina por cromatografía líquida de alto rendimiento con detección electroquímica. Para las muestras tomadas de la corteza prefrontal, que tiene mucho más bajas concentraciones de dopamina extracelular, se utiliza una parte alícuota de 1 l de etanol para el análisis de una muestra de 7 min utilizando una velocidad de flujo de 1,0 l / min. 7. Microdiálisis procedimientos posteriores Después de la conclusión del experimento de microdiálisis, anestesiar la rata y retirar la sonda. Vuelva a colocar el obturador si el animal no es sacrificado inmediatamente. Recoger el cerebro dentro de los tres días del experimento. De lo contrario, la visualización del tracto sonda puede no ser posible. El cerebro debe ser eliminado in acuerdo con los protocolos aprobados animales de uso. Usamos pentobarbital sódico (150 mg / kg, ip) sobredosis, seguido de la perfusión cardiaca con solución salina y después de la formalina en solución salina. Sumergir cerebro en una solución de formalina salina durante al menos 12 horas antes de seccionar. Sección coronal del cerebro en rodajas 100 micras. Stain rebanadas con cresil violeta, y examinar la colocación de la sonda correcta. 5, 6 8. Análisis de las muestras para la concentración de etanol Las muestras recogidas, así como normas externas (0,3125 a 20 mM de etanol) se ejecutan en nuestro cromatógrafo de gases con sistema de detección de ionización de llama. Este sistema se compone de un cromatógrafo de gases Varian CP 3800 con un detector de ionización de llama, un Bruker (Varian) 8400 espacio de cabeza del inyector automático calienta a 50 ° C, y una columna capilar HP INNOWax (30 mx 0,53 mm x 1,0 m de espesor de película), con helio como fase móvil. Los cromatogramas se registran y analizan con Chromatography software tal como el software Varian Star Cromatografía de estación de trabajo que va a ser discutido específicamente aquí. Para preparar el sistema para el análisis de etanol, calentar la placa del inyector automático usando un baño de agua de recirculación, y abrir los dos tanques adicionales de gas (aire e hidrógeno, helio se deja siempre corriendo para preservar la columna de cera). Registre las presiones de los tanques de gas, así como el número de muestras que tengan la intención de correr para que pueda llevar la cuenta del número de veces que la fibra y el tabique se han utilizado de manera que se puede cambiar cuando sea apropiado (fibra-500 inyecciones; tabique -100 pinchazos). Iniciar el procedimiento de puesta en marcha, que prepara el sistema para que ejecute las muestras (los parámetros del programa de la Tabla 2). Espere a que el sistema para informar de que se trata de "Ready". Iniciar un 20-min "quemar", que prepara la fibra para el análisis de la muestra sometiéndola a una temperatura alta para desorber cualquier contaminante que haya absorbido mientras está en reposo. Las normas son hechas pordilución de 238 l de etanol al 95% con agua hasta un volumen final de 100 ml en un matraz volumétrico en una campana química. Esto crea una solución de etanol 40 mM. Usamos una dilución 1:1 en serie para crear 20, 10, 5, 2,5, 1,25, 0,625, 0,3125 mm Normas. Para cada concentración de estándar, utilizar el mismo volumen alícuota que se tomarán de las muestras de diálisis. Pipetear la parte alícuota en un vial de vidrio de 2 ml y, a continuación sellar el vial con un tabique hermético de aire. Todas las muestras de etanol se calientan en el inyector automático hasta que la alícuota de líquido entero se ha vaporizado. Calentamos nuestras muestras durante aproximadamente 30 min. En esta sección se describe el software de estación de trabajo Star que utilizamos con nuestro cromatógrafo de gases. Otro software puede ser utilizado, pero la descripción a continuación pueden no ser aplicables. Para ejecutar muestras, crear una lista de ejemplo señalar que la muestra es en qué ranura inyector automático, y las veces que la muestra debe ser perforado. Asegúrese de que la ruta de los archivos de datos en su pliegue seleccionadoer. A continuación, seleccione el método de elección para sus muestras, y comenzar la carrera. Usamos los parámetros de funcionamiento indicados en la Tabla 2. Nuestro programa de etanol dializado absorbe la muestra durante 3 min y se desorbe en la corriente de helio, que se alimenta en la columna de la cera, durante 1 min. Sin embargo, los programas pueden ser escritos para adaptarse a sus necesidades específicas. Los componentes de la muestra separados en la columna de la cera, y luego pasar por el detector de ionización de llama, donde el carbono que contiene compuestos, tales como iones de etanol, combustos y liberación. Esto da lugar a aumento del flujo de electrones desde el ánodo del detector para el cátodo creando una corriente, que se convierte en voltaje y grabado resultante en cromatogramas como la que se muestra a continuación (Figura 1). El cambio en la tensión es proporcional a la cantidad de carbono que pasa a través del detector a través de tiempo.7 Después de que el sistema termine de ejecutarse las muestras que usted tendrá que comprobar la integración de cada pico. Para el software de estación de trabajo Star,haga clic en el icono de pico azul en la barra de herramientas. Haga clic en el color de cada pico y arrastrar las flechas para ajustar la línea de base. Vuelva a integrar cada pico antes de pasar al siguiente grupo de picos. El software de análisis de pico puede ser cualquier software de cromatografía general. Para el software de estación de trabajo Star, haga clic en el icono de informes por lotes en la barra de herramientas. Arrastra cada muestra de la carpeta especificada al informe de lotes para imprimir los informes de ejemplo. Software de informes se pueden personalizar con los sistemas de software más comunes de cromatografía. Los informes pueden ser programados para mostrar la información de su elección. Actualmente usamos la altura del pico, pero los informes también puede ser programado para usar el área del pico. Para apagar el sistema, iniciar el procedimiento de desconexión (parámetros indicados en la Tabla 2), apague el baño de agua, y cerca de los tanques de hidrógeno y de aire cuando la temperatura del horno de columna alcanza los 30 ° C. 9. Datos del etanol Trazar la altura del pico comouna función de cada concentración conocida externo etanol estándar (Figura 2A). Utilizar la función lineal dada por estos puntos para calcular la concentración de etanol a partir de la altura de pico dada por cada muestra de dializado. Al graficar la concentración de etanol en el líquido de diálisis a través del tiempo, podemos ver el patrón de los niveles de etanol en la región cerebral de interés durante nuestra sesión de comportamiento. Ejemplo de datos, que se muestran a continuación (Figura 2B), se representan como la concentración de etanol en el dializado a través del tiempo durante la sesión de autoadministración. 10. Mantenimiento general: La fibra debe cambiarse cada 500 perforaciones, y el tabique de la cada 100 punciones Para cambiar la fibra En el cromatógrafo de gases tecla Menú pulse el parche, seleccione 8400, enter, seleccione jeringa cambio, pulse Intro. El automuestreador se posicionará para permitir la fibra (Fiber Asamblea SPME, 75 m Carboxen-PDMS, Supelco Analítica, Bellefonte, PA) para ser eliminado. Abra la puerta que cubre la fibra. Desenroscar la tuerca de bloqueo, y mover el pestillo para permitir que el conjunto de fibras para ser eliminado. Tome el conjunto de fibras fuera. Desenroscar la tuerca que sujeta la fibra en la asamblea, y luego desenroscar la fibra. Cambiar la fibra del viejo por uno nuevo, y volver a montar el conjunto de fibras. Vuelva a colocar el conjunto en el muestreador automático, re-enganche y atornillar el conjunto en su lugar. Cuando haya terminado, pulse el botón "cambiar done" en el teclado, y el inyector automático estará listo para su uso propio. Para cambiar el septum En primer lugar, desenroscar el tapón que cubre el tabique (Hi-Temp 0.450 Dia. Genérico acondicionado Septa, Varian) y retire el tabique de edad. Asiente el septum nuevo abajo en el accesorio. Vuelva a enroscar el tapón y apriételo con la llave. A continuación, utilizar una aguja de inyección para perforar el tabique de manera que la fibra no se rompe la primera vez que se perfora el septum. </ol> 11. Los resultados representativos La Figura 1 muestra los cromatogramas de ejemplo para tres concentraciones de etanol y normas para una muestra de dializado rata recogido al final del etanol auto-administración de sesiones. Picos de etanol debe ser relativamente simétrica, tienen tiempos de retención consistentes, y una relación de señal a ruido> 10. Si no se cumplen estos criterios, significa que el sistema requiere mantenimiento. Cromatografía de estándares de calidad y correctamente preparados de producir una curva estándar lineal (R2 ≥ 0,99; Figura 2A) que se utiliza para calcular la concentración de etanol de las muestras de dializado recogido en etanol auto-administración de animales en el transcurso de su auto-administración de sesiones (Figura 2B) . Figura 1. Ejemplo cromatogramas. Un microlitro de etanol estándar o de la muestra de dializado se cargó en un gas chromatograph vial y se analizaron como se describe en el texto. A) superposición de los picos generados de 2,5, 5,0 y 10 mM de etanol normas. B) Pico generada a partir de una muestra de líquido de diálisis de una rata que tiene autoadministrado etanol. Figura 2. Los resultados gráficos del experimento de ejemplo que se muestra en la figura 1. A) Etanol curva estándar. B) Evolución temporal de la concentración de etanol líquido de diálisis a través de una mezcla de etanol autoadministración sesión. Hardware Parámetro Puesta en valor Ejecución de ajuste Ajuste de reclinación 8400 Bruker (Varian) Autosampler Inyección de modo SPME SPME n / a <tr> Profundidad de penetración de los disolventes 0% 20% n / a Ejemplo de profundidad de penetración 20% 20% n / a Absorción tiempo 0,01 min 3 min n / a Desorción tiempo 19 min 1 min n / a Limpie el modo de fuente solvente Yo Yo n / a Clean modo de adsorción y desorción tiempo 0,01 min 0,01 min n / a Baño de agua (inyector automático calienta) * 50 ° C 50 ° C De CP-3800 cromatógrafo de gases Varian Inyector Horno </td> Horno poder En En En Temperatura del horno 250 ° C 220 ° C 30 ° C Estufa de columna Tiempo de estabilización 0,10 min 0,10 min 0.10min Temperatura 65 ° C 65 ° C 30 ° C Columna Fase móvil caudal 8,5 ml / min 8,5 ml / min n / a Columna de presión ~ 6 psi ~ 6 psi ≥ 0,1 psi Detector FID Horno poder En En En Temperatura 220 ° C 220 ° C 120 ° C </tr> Electrónica En En De Constante de tiempo Rápido Rápido Rápido Alcance 11 11 11 Autocero Sí Sí Sí Tabla 2. Cromatógrafo de gases con los parámetros del sistema de detección de ionización de llama. Esta tabla muestra los parámetros para los tres programas que se utilizan para preparar (ajustes de inicio), Run (ejecutar ajustes) y mantener el sistema cuando no está en uso (valores de reposo).