Microdialysis من الإيثانول خلال فعال الإيثانول الإدارة الذاتية والايثانول تقرير بواسطة جهاز الكروماتوجرافي الغازي
Summary
وهناك طريقة لتحديد مسار الوقت للتركيز الإيثانول في أدمغة الفئران من خلال الإيثانول فعال يوصف الإدارة الذاتية. يتم استخدام اللوني للغاز مع الكشف عن تأين اللهب لتحديد الايثانول في عينات ديالة، لأنه لديه حساسية المطلوبة لكميات صغيرة التي يتم إنشاؤها.
Abstract
ويشيع استخدام فعال أساليب الإدارة الذاتية لدراسة التأثيرات السلوكية والدوائية العديد من الأدوية من سوء المعاملة، بما في ذلك الإيثانول. ومع ذلك، الإيثانول هو عادة الذاتي عن طريق الفم، بدلا من الوريد مثل أدوية أخرى عديدة من سوء المعاملة. الدوائية من الأدوية عن طريق الفم هي أكثر تعقيدا من المخدرات تدار عن طريق الوريد. لأن فهم العلاقة بين التأثيرات الدوائية والسلوكية من الإيثانول يتطلب معرفة مسار الوقت من الإيثانول الوصول إلى المخ أثناء وبعد الشرب، ونحن نستخدم في الجسم الحي وmicrodialysis اللوني للغاز مع الكشف عن تأين اللهب لرصد تركيزات الإيثانول ديالة الدماغ مع مرور الوقت.
الجمع بين microdialysis السلوكي التجارب تنطوي على استخدام العديد من التقنيات. في هذه المقالة، والجراحة التجسيمي والتدريب السلوكي وmicrodialysis، والتي يمكن تكييفها لاختبار عدد كبير من الإدارة الذاتية وNEUيتم تضمين rochemical تركز الفرضيات، فقط لتوضيح الكيفية التي تتصل المراحل اللاحقة من جمع العينات والتحليل ديالة الايثانول. يوصف ديالة الإيثانول التحليل اللوني للغاز عبر التركيز مع التأين كشف اللهب، والتي هي محددة لدراسات الإيثانول، بالتفصيل. البيانات التي تنتجها هذه الأساليب تكشف عن نمط من الإيثانول الوصول إلى المخ أثناء إجراء الإدارة الذاتية، وعندما يقترن مع تحليل العينات الكيميائية العصبية من ديالة نفسه، يسمح لتكون الاستنتاجات بشأن الآثار الدوائية والسلوكية من الايثانول.
Protocol
Discussion
التطبيقات والقيود
يتم استخدام المخدرات في الإدارة الذاتية القوارض إلى إدمان المخدرات النموذج. يمكن أن تدار العديد من الأدوية التي يتم الاعتداء على هذا النحو على غرار عن طريق الوريد، حيث يتم تسليم المخدرات مباشرة إلى حجرة المركزية. وهذا يسمح للمراقبة عن كثب من جرعة عبر جلسة عمل الإدارة الذاتية. منذ الإيثانول هو عادة شفويا ذاتيا، فمن أصعب بكثير لمراقبة مستويات الدواء بسبب الفروق الفردية في امتصاص والتمثيل الغذائي. باستخدام عينة من microdialysis إلى المنطقة الدماغ من الفائدة، ونحن ليس فقط قادرة على رصد نمط الإيثانول الوصول إلى المنطقة، ولكن نحن أيضا قادرة على رصد التغيرات في وقت واحد عصبي في نفس المنطقة مع مرور الوقت خلال كل مرحلة الإدارة الذاتية.
ترتبط التغيرات الكيميائية العصبية واستجابات المخدرات التي يسببها في المخ مع تعاطي المخدرات والاعتماد عليها، وبالتالي فإن القدرة على شركة طيران الشرق الأوسط في وقت واحدوتركيزات الكيميائية العصبية متأكد من المخدرات خلال مراحل معينة من الإدارة الذاتية يوفر أداة قوية جدا وفريدة من نوعها. مسألة واحدة أن نأخذ في الاعتبار لربط تركيزات ديالة من analytes مع السلوك هو الخصائص الفيزيائية للالسباكة microdialysis. على وجه التحديد، والوقت الذي يستغرقه للسوائل على أن يتم تحويلها من تجويف التحقيق microdialysis إلى أنبوب جمع أمر بالغ الأهمية، وأقصر الأوقات أفضل. في المختبر لدينا، ونحن بناء تحقيقات بحيث الساعة حوالي 90 ثانية. باستخدام هذه الشروط، وجدنا أن هناك زيادة الدوبامين accumbal في الشروع في استهلاك الإيثانول، مما يقلل على مدى فترات الشراب والشراب آخر، كما يزيد تركيز الإيثانول ديالة. 2،3،8،9 هذه التجارب ، وعندما يقترن البيانات من الدراسات الدوائية، سمحت لنا باستبعاد الآثار الدوائية بدقة من الإيثانول والإدارة الذاتية العظة البيئية المرتبطة على الفصلanges في تركيزات العصبي.
تجدر الإشارة إلى أن هذا التطبيق هي مناسبة خاصة للتقنيات سلوكية-microdialysis مجتمعة إلى الاهتمامات البحثية الحالية من مختبرنا. وهي مصممة لتقييم نمط الزمني للالإيثانول الوصول إلى المخ بالمقارنة مع نمط التغييرات العصبي في نفس المنطقة، حتى نتمكن من ربط هذه التدابير إلى سلوكيات الإدارة الذاتية متزامن. عدم معالجة الإيثانول ديالة المستمدة تركيزات لتحقيق الانتعاش في الجسم الحي، وفقط جزء صغير من الأنسجة تركيز الدماغ الايثانول. إذا كان مطلوبا microdialysis الكمية من الإيثانول، ينبغي الكسر استخراج الإيثانول من أن ينشر في الفضاء خارج الخلية التحقيق تحديد تجريبيا. انظر المنشورات السابقة من مختبرنا للطرق ومزيد من المناقشة. 10،11،12
على الرغم من أن هذا البروتوكول يوضح استخدام الغاز CHromatography جنبا إلى جنب مع microextraction الطور الصلب الإيثانول من فراغ الرأس الموجود لعينات microdialysis، يمكن أن تستخدم أساليب أخرى لتحليل مضمون الإيثانول من العينة microdialysis. ومع ذلك، قد طرق بديلة تعاني من بعض العيوب. على سبيل المثال، قد الأساليب التحليلية أقل حساسية تتطلب حجم عينة أكبر وهو الأمر الذي يتطلب أخذ العينات مرات أكبر من 5-7 دقائق يتضح هنا. نوع نظام مناقشتها هنا يستخدم microextraction المرحلة الصلبة التي تركز على الايثانول في مرحلة البخار في قارورة العينة مختومة من خلال السماح لامتصاص الألياف توضع في فراغ الرأس الموجود القارورة. هذا يحسن من حد الكشف مقارنة مع أخذ العينات فراغ الرأس مباشرة والذي يسمح عادة ليتم حقنه 50-100 microliters من بخار. آخر ميزة كبيرة للطريقة فراغ الرأس هو أن عينة للتحليل حقن نظيفة للغاية وخالية من الأملاح. ويمكن أيضا حقن المباشر للعينة السائل microdialysis أن تستخدم مع ارتفاع sensitivity، ولكن هذا سوف يتطلب المزيد من الوقت لأسفل الصك بسبب الصيانة الدورية اللازمة لتنظيف الأملاح حقن.
حل المشاكل والملاحظات الأخرى
- قبل تجربتك تبدأ، تعطي لنفسك متسع من الوقت للتأكد من أن لديك microdialysis مجموعة عمليات تعمل بشكل صحيح وتبادل لاطلاق النار المتاعب أي قضايا. نقترح أن يكون لديك مبلغ إضافي انشاء، perfused مع ACSF، وعلى استعداد للتبديل خارجا مع خلل انشاء لتوفر على نفسك الوقت، ومعظم دورات فعال تميل إلى أن تحدث في وقت محدد كل يوم.
- تأكد من أن يتم إدراج تحقيقات microdialysis على مدى فترة من حوالي 5 دقائق للحد من تلف الأنسجة التي تنتجها القص من نسيج والتحقيق تخترق الدماغ.
- عند نقل الفئران الى غرفة فعال فإنه من المفيد أن يكون الشخص الثاني بحيث تساعد خط النقل (جزء من مجموعة microdialysis متابعة) لا تصبح متشابكة، وبحيث يمكن الحرف الأول برنامج فعالiated في الوقت المحدد.
- تأكد من إعطاء حمام مائي الاوتوماتيكى متسع من الوقت للوصول إلى درجة الحرارة المناسبة. نظامنا عادة ما يتطلب ساعتين لتصل إلى 50 ° C. أيضا، تأكد من أن يتم تبخيرها العينات الخاصة بك بشكل كامل قبل تحليل العينات. ونحن عادة تأكيد بصريا أن هذا قد حدث قبل بدء تحليل العينة.
- وينبغي اتباع الممارسات مستوى جيد الكيمياء التحليلية. هذه تشمل، ولكنها لا تقتصر على، والمصادقة من الأفراد والمعدات والإجراءات. وباختصار، نحن توظيف الإرشادات التالية: يجب أن تظهر للمستخدمين الأفراد القدرة على توليد قيم الارتفاع استنساخه الذروة لتركيزات القياسية والمنحنيات القياسية الخطي (R2 ≥ 0.99) عبر عدة أيام. للتحقق من نظام GC-FID يعمل بشكل صحيح، يجب أن يكون دائما معايير يتم تحليلها قبل أن يتم حقن أي عينات ديالة. ينبغي أن منحنى القياسية ولدت لديها R2 ≥ 0،99.
- معظم المعدات التي نستخدمهاتم شراؤها من خلال فاريان، وشركة، والتي تم الحصول عليها بواسطة تقنيات اجيلنت في عام 2010. في هذا الوقت، حصلت بروكر الأدوات العلمية فاريان في مختبر الغاز اللوني الأعمال الصكوك. لمشتريات في المستقبل، إما استشارة الشركة.
- هذا البروتوكول يظهر السلوك فعال مع الفئران، ولكن المشاهد أن تكون على علم أن أكثر من اضطراب السلوك من المحتمل أن تحدث مع نموذج أصغر الماوس. وثمة مسألة أخرى ليكون على بينة من هو هذا الموضع من تحقيق microdialysis إلى مناطق أخرى من الدماغ من القشرة قبل الجبهية وسطي أو النواة المتكئة قد يعطل السلوك فعال إلى درجة أكبر من المعروضة هنا. من المهم أن تدرس بدقة المعايير السلوكية عديدة لتحديد ما إذا كان الضرر الناتج عن موضع التحقيق ينتج تغيرات شديدة في السلوك.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا البحث من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح من / NIAAA (AA11852 وAA007471).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| 95% Ethanol | AAPER Alcohol and Chemical Co., Shelbyville, KY | E190, 111000190 |
| Ultra-Pure Sucrose | MP Biomedicals, LLC, Solon, OH | 821721 |
| Ultra High Purity Helium | Air Gas | HE UHP300 |
| Air | Air Gas | AIZ300 |
| Hydrogen | Air Gas | AIZ300 |
| GC 2 ml vials | Agilent | #8010-0015 |
| GC vial caps with PTFE/silicone septa | Agilent | #8010-0084 |
Table 1. Specific reagents
References
- Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable stereotaxic surgery in rodents. J. Vis. Exp. (20), e880 (2008).
- Howard, E. C., Schier, C. J., Wetzel, J. S., Gonzales, R. A. The dopamine response in the nucleus accumbens core-shell border differs from that in the core and shell during operant ethanol self-administration. Alcohol Clin. Exp. Res. 33, 1355-1365 (2009).
- Doyon, W. M., York, J. L., Diaz, L. M., Samson, H. H., Czachowski, C. L., Gonzales, R. A. Dopamine activity in the nucleus accumbens during consummatory phases of oral ethanol self-administration. Alcohol Clin. Exp. Res. 27, 1573-1582 (2003).
- Pettit, H. O., Justice, J. B. Effect of dose on cocaine self-administration behavior and dopamine levels in the nucleus accumbens. Brain Res. 539, 94-102 (1991).
- Paxinos, G., Kus, L., Ashwell, K. W. S., Watson, C. . Chemoarchitectonic Atlas of The Rat Forebrain. , (1998).
- Paxinos, G., Watson, C. . The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , (1986).
- Skoog, D. A., Holler, F. J., Nieman, T. A. . Principles of Instrumental Analysis. , (1998).
- Doyon, W. M., Anders, S. K., Ramachandra, V. S., Czachowski, C. L., Gonzales, R. A. Effect of operant self-administration of 10% ethanol plus 10% sucrose on dopamine and ethanol concentrations in the nucleus accumbens. J Neurochem. 93, 1469-1481 (2005).
- Carrillo, J., Gonzales, R. A single exposure to voluntary ethanol self-administration produces adaptations in ethanol consumption and accumbal dopamine signaling. Alcohol. 45, 559-5566 (2011).
- Howard, E. C., Schier, C. J., Wetzel, J. S., Duvauchelle, C. L., Gonzales, R. A. The shell of the nucleus accumbens has a higher dopamine response compared with the core after non-contingent intravenous ethanol administration. Neuroscience. 154, 1042-1053 (2008).
- Robinson, D. L., Lara, J. A., Brunner, L. J., Gonzales, R. A. Quantification of Ethanol Concentrations in the Extracellular Fluid of the Rat Brain. J. Neurochem. 75, 1685-1693 (2000).
- Gonzales, R. A., McNabb, J., Yim, H. J., Ripley, T., Bungay, P. M. Quantitative Microdialysis of Ethanol in Rat Striatum. Alcohol Clin. Exp. Res. 22, 858-867 (1998).
