Microdialyse van alcohol tijdens de operante ethanol zelftoediening en ethanol bepaling door gaschromatografie

1. Stereotaxische Chirurgie Alle procedures volgen de NIH gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren en werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite. Met een stereotaxische inrichting goed behandeld Long-Evans ratten verdoofd met isofluraan, geïmplanteerd met een 21-gauge canule (voor later microdilaysis probe insertie) (Plastics One, Roanoke, VA) boven de hersenen gebied van belang en een tether bout is ingebouwd in de kop stadium (gebruikt bij de microdialyse-apparatuur te ondersteunen). Zorgvuldig te controleren ratten tijdens en na de operatie. Zorg ervoor dat alle dieren ten minste een week van post-operatieve zorg en herstel ontvangen en zijn gezond voor het begin van de volgende procedures. Een Jove video van de stereotactische operatie methode beschikbaar is. 1 2. Operante Training Na een week post-chirurgisch herstel worden de dieren getraind om hefboom pers 10% sucrose solution in een Med Associates operante kamer (MedAssociates, Inc, Vermont, USA) uitgerust met een lickometer, intrekbare hendel en sipper buis (zoals eerder beschreven in Howard et al.., 2009). 2 Software van MedAssociates wordt gebruikt om alle ontwerpen operant's (MedAssociates, Inc, Vermont, USA). Eenmaal getraind om op voor sucrose, ratten allereerst een geschikte trainingsschema waarbij ethanol geleidelijk toegevoegd aan de oplossing over meerdere sessies drinken. Bijvoorbeeld, onze lab gebruikt momenteel een 8-daagse training schema, waarbij ethanol is vervaagd in de oplossing afgesloten met een 10% ethanol / 10% sucrose drinken oplossing. Controle dieren ontvangen slechts 10% sucrose of geen drinken oplossing. Het specifieke type operant schema te gebruiken kan sterk variëren, maar de algemene procedures hieronder beschreven voor microdialyse bemonstering nog worden uitgevoerd. Drie 3. Pre-microdialyse Procedure: Tethering <ol> De avond voor de een na laatste training (in ons voorbeeld is dit de 7e training), worden de dieren gewend aan de ketting lente, die aan de ketting bout hecht op hun hoofd podium. De veer wordt bevestigd aan de microdialyse zwenk-en tegengewicht hefboomarm, die naast de kooi opgehangen, zodat met een ring stand en klemmen dat het dier vrij kan bewegen binnen zijn kooi. Tethered dieren brengen de nacht door in de operante kamer, in hun huis kooi met ad libitum voedsel en water, om ze te wennen aan de tethering-opgericht. De volgende dag, de rat voltooit zijn operant programma met de ketting op zijn plaats, om het dier wennen aan het gevoel van de ketting tijdens het uitvoeren van zijn gedrag taken. Monteer de tethering apparaat aan de wand van de operante kamer in de buurt van de top tot opschorting van de ketting en draaibare boven het midden van het dak van de operante kamer mogelijk te maken. Dit alles wordt geplaatst binnen de geluidwerende kamer. After de sessie, de terugkeer van de rat naar zijn kooi op de operante kamer te microdiaysis sonde inbrengen af ​​te wachten. 4. Pre-microdialyse Procedures: De microdialyse sonde wordt de dag vóór de microdialyse experiment, nadat de rat is voltooid gedragstraining voor de dag De dag voor de microdialyse experiment, is na de rat voltooide een operante sessie terwijl vastgebonden, de rat verdoven met isofluraan en verwijder de obturator uit de gids canule. Langzaam (over ~ 5 min) plaats een microdialyseproben geperfundeerd met kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF), door de craniale geleidingscanule in de hersenen gebied van belang. We maken gebruik van laboratorium-geconstrueerde sondes en microdialyse procedures gemodelleerd naar Doyon et al.., 2003, en Pettit en Justitie, 1991. 3, 4 De eerder besproken tethering de inrichting en afvoerleidingen van de sonde boven het dier te schorten. Draai de probe debiet tot 0,2 ul / min. Nogmaals, de rat brengt de nacht in de operante kamer. 5. Microdialyse Procedure: Het verzamelen van monsters tijdens zelftoediening sessie met gescheiden appetitieve en consummatory fasen Ten minste 2 uur voor het experiment begint, zet de sonde zijn werk debiet. We gebruiken ofwel 1.0 of 2.0 ul / min afhankelijk van het hersengebied. Controleer of de probe debiet consistent is en ten minste 90% van de ingestelde stroom met een Hamilton spuit volume te meten tijd. Dialyse monsters (5 of 7 min) worden voor, tijdens en na de operante sessie. De bemonstering is afhankelijk van het hersengebied, neurotransmitter geanalyseerd, dialysaat concentratie van de analyt, en de gevoeligheid van de analytische chemie apparatuur worden gebruikt voor de analyse. De gedrags fasen zijn: Baseline: Aan het begin van het experiment,verzamelen dialyse monsters in het huis van de dier kooi (4 monsters). Transfer: Na het verzamelen van kooi basislijn monsters, de rat over te dragen aan de operante kamer. Overdracht van de tethered rat vereist grote zorgvuldigheid om ervoor te zorgen dat de microdialyse vloeistof overdracht lijn niet verward worden, en dat de rat blijft kalm. Onmiddellijk na de overdracht, activeert u de operante programma u vanaf de basislijn / overdracht monster naar de eerste wachten monster. Wachten: Blijf monsters als rat wacht de hefboom uit te breiden in de kamer (3-4 samples afhankelijk hersengebied). Drinken: Na de hendel wordt gepresenteerd en geperst, een fles drinken oplossing (10% sucrose/10% ethanol of 10% sucrose) wordt ter beschikking gesteld van de rat gedurende ongeveer 20 minuten (3-4 monsters). Post-drank: Na drink periode, de fles trekt, maar de rat blijft in de operante kamer voor ongeveer 20 minuten (3-4 monsters). 6. Microdialyse Procedure: Voorbereiding van microdialyse monster voor ethanol analyse Twee monsters voordat de dieren zelf het beheer van de ethanol-oplossing, en alle monsters na, worden geëvalueerd voor ethanol concentratie. Pipetteer een 1 of 2 pi aliquot van het monster van interesse in een 2 ml glazen flacon. Dan sluit de flacon met een luchtdichte septum (9 mm Rood Poly Schroefdop, PTFE / Sil Septa, Agilent Technologies). Het volume van de hoeveelheid ethanol analyse (1 of 2 pi) afhankelijk van het totale volume en het monstervolume vereist extra analyses. Indien de monsters zullen worden gebruikt voor later neurochemische analyse Het monster na het pipetteren de juiste hoeveelheid voor kwantificering ethanol. Bijvoorbeeld, onze lab analyseert de monsters voor dopamine. Om dit te bereiken, plaatst de monsters op droog ijs tijdens het experimenten dan slaan de monsters bij -80 ° C na het experiment. We gebruiken 2 ui aliquots voor ethanol analyse van een 5 min monster verzameld met een stroomsnelheid van 2,0 ul / min voor sondes in de nucleus accumbens. Dit maakt ten minste 7 pl resterende latere analyse van dopamine met hoge prestatie vloeistofchromatografie met elektrochemische detectie. Voor monsters van de prefrontale cortex, die een veel lagere extracellulaire dopamine concentraties heeft, gebruiken we een 1 pi aliquot van ethanol uit een analyse van 7 min monster met een stroomsnelheid van 1,0 ul / min. 7. Post-microdialyse procedures Na het sluiten van de microdialyse experiment, verdoven de rat en verwijder de sonde. Vervang de obturator indien het dier niet onmiddellijk gedood. Verzamel de hersenen binnen drie dagen na het experiment. Anders kan visualisatie van de probe darmkanaal niet mogelijk. De hersenen worden verwijderd in overeenstemming met goedgekeurde gebruik van dieren protocollen. We gebruiken natriumpentobarbital (150 mg / kg, ip) overdosering, gevolgd door cardiale perfusie met fysiologisch zout en formaline in zoutoplossing. Onderdompelen hersenen in een formaline-zoutoplossing gedurende ten minste 12 uur vóór het snijden. Coronaalwaarts sectie van de hersenen in 100 micrometer plakjes. Stain schijfjes met cresyl violet, en te onderzoeken voor de juiste sonde plaatsing. 5, 6 8. Analyse van de monsters voor ethanolconcentratie De verzamelde monsters, alsook externe normen (0,3125 tot 20 mM ethanol) worden uitgevoerd op onze gaschromatograaf met een vlam ionisatie detectie systeem. Dit systeem bestaat uit een Varian CP 3800 gaschromatograaf met een vlamionisatiedetector, een Bruker (Varian) 8400 autosampler headspace verwarmd tot 50 ° C, en een HP Innowax capillaire kolom (30 mx 0,53 mm x 1,0 um laagdikte) met helium als mobiele fase. Chromatogrammen worden geregistreerd en geanalyseerd met Chromatography software, zoals de Varian Star Chromatografie Workstation software die hier specifiek zullen worden besproken. Om het systeem voor te bereiden op ethanol analyse, verwarm de autosampler plaat met behulp van een recirculerende waterbad, en open de twee extra gastanks (lucht en waterstof; helium is altijd laat draaien om de was kolom te behouden). Noteer de gastank druk, evenals het aantal monsters dat u van plan dit te draaien dat je telling van het aantal keren dat houden de vezels en septum zijn gebruikt, zodat ze kunnen indien nodig (vezel-500 injecties worden gewijzigd; septum -100 puncties). Start de start-up methode, die het systeem om monsters (programma parameters in tabel 2) run bereidt. Wacht totdat het systeem te melden dat het "Ready". Start een 20-min "branden", die de vezel voor monsteranalyse bereidt door het aan een hoge temperatuur te desorberen mogelijke verontreinigingen is opgenomen in rust. Normen worden gemaakt doorverdunnen 238 pi van 95% ethanol met water tot een eindvolume van 100 ml met een maatkolf in een zuurkast. Hierdoor ontstaat een 40 mM ethanol. We gebruiken een 1:1 seriële verdunning tot 20, 10 maken, 5, 2,5, 1,25, 0,625, 0,3125 mM normen. Voor elke concentratie van standaard gebruiken dezelfde hoeveelheid volume dat wordt uit de dialyse monsters. Pipetteer het monster in een 2 ml glazen flesje, en dan het flesje af te dichten met een luchtdichte septum. Alle ethanol monsters worden verwarmd in de autosampler totdat de gehele hoeveelheid vloeistof is verdampt. Wij verwarmen onze monsters gedurende ongeveer 30 minuten. Deze paragraaf beschrijft de Star Workstation software die we gebruiken met onze gaschromatograaf. Andere software kan worden gebruikt, maar de onderstaande beschrijving niet van toepassing. Om monsters te draaien, maakt u een lijst met voorbeelden van merken die monster waarin autosampler slot, en hoe vaak het monster moet worden doorboord. Zorg ervoor dat u de route van de gegevensbestanden op uw geselecteerde vouwer. Selecteer vervolgens de methode van keuze voor uw monsters, en beginnen met de run. We gebruiken de bedrijfsparameters vermeld in tabel 2. Het dialysaat ethanolprogramma absorbeert het monster gedurende 3 minuten en desorbeert in de stroom helium, die weer de was kolom, 1 min. Echter, kunnen programma's worden geschreven om aan uw specifieke wensen tegemoet te komen. De monstercomponenten in de was afzonderlijke kolom en dan door de vlamionisatiedetector waar de koolstof bevattende verbindingen, zoals ethanol, en laat verbranden ionen. Dit verhoogt elektronenstroom van de detector anode naar de kathode creëren van een stroom, die wordt omgezet in spanning en opgenomen waardoor chromatogrammen zoals hieronder getoond (Figuur 1). De verandering in spanning is evenredig met de hoeveelheid koolstof die door de detector in time.7 Nadat het systeem is voltooid het uitvoeren van de samples die u nodig hebt om de integratie van elke piek te controleren. Voor Star Workstation software,klik op de blauwe piek pictogram in de werkbalk. Klik op kleur die elke piek en sleep de pijlen om de basislijn te passen. Re-integreren elke piek voordat u naar de volgende groep van pieken. De piek analyse software kan alle algemene chromatografie software. Voor Star Workstation software, click op de batch rapport pictogram in uw werkbalk. Sleep elk monster van uw opgegeven map naar de batch rapport aan het monster rapporten af ​​te drukken. Rapportage software kan worden aangepast met de meest gangbare chromatografie software systemen. De rapporten kunnen worden geprogrammeerd om de informatie van uw keuze weer te geven. Momenteel gebruiken we piekhoogte, maar de rapporten kunnen ook worden geprogrammeerd om piekoppervlakte te gebruiken. Voor het afsluiten van het systeem, start u de shut-down methode (parameters vermeld in tabel 2), zet het waterbad, en sluit de waterstof en lucht tanks als de kolom oven temperatuur bereikt 30 ° C. 9. Ethanol gegevens Teken de piekhoogte alseen functie van elke bekende uitwendige standaard ethanol concentratie (Figuur 2A). Gebruik de lineaire functie gegeven door deze punten de ethanolconcentratie berekenen van de piekhoogte door elk monster dialysaat. Getrokken waarbij de concentratie van ethanol in het dialysaat tijd, we het patroon van ethanol in de hersenen gebied van belang tijdens onze gedrag sessie. Voorbeeld gegevens hieronder (Figuur 2B) worden weergegeven als de concentratie van ethanol in het dialysaat in de tijd tijdens het zelf toedienen sessie. 10. Algemeen onderhoud: De vezel moet worden veranderd om de 500 puncties, en het septum elke 100 puncties Om de vezel te wijzigen Op de gaschromatograaf toetsenbord drukt u op Menu, selecteert u 8400, druk op enter, selecteer verandering spuit, druk op enter. De autosampler zal positioneren om de vezel (SPME Fiber Vergadering, 75 micrometer Carboxen-PDMS, Supelco Analytische, BellefoNTE, PA) te verwijderen. Open de deur met betrekking tot de vezel. Draai de borgmoer, en beweeg de grendel om de vezel montage worden verwijderd. Neem de vezel voorzichtig uit. Draai de moer waarmee de vezels in de vergadering houdt, en schroef de vezel. Vervang de oude vezel met een nieuwe, en monteer de vezel montage. Vervang de montage in de autosampler, opnieuw vergrendelen en schroeven van de montage op zijn plaats. Als u klaar bent, drukt u op "wijzigen gedaan" op het toetsenbord, en de autosampler zal klaar zelf voor gebruik. Om het septum te wijzigen Ten eerste, draai de beschermdop van de septum (Hi-Temp 0.450 Dia. Generic Geconditioneerde Septa, Varian) en verwijder de oude septum. Plaats de nieuwe septum naar beneden in de fitting. Re-schroef de dop en draai deze vast met de moersleutel. Gebruik vervolgens een injectienaald te doorboren van het septum, zodat de vezel niet breken eerst de septum geprikt wordt. </ol> 11. Representatieve resultaten Figuur 1 toont bijvoorbeeld chromatogrammen drie concentraties ethanol normen en een rat dialysaat monster verzameld aan het einde van de ethanol zelftoediening sessie. Ethanol pieken moeten relatief symmetrisch, hebben consistente retentietijden en een signaal-ruisverhouding> 10. Het niet voldoen aan deze criteria houdt in dat uw systeem onderhoud nodig heeft. Kwaliteit chromatografie en kunnen bereid normen een lineaire ijklijn (R2 ≥ 0,99; figuur 2A) die wordt gebruikt om de concentratie van ethanol dialysaat monsters van ethanol berekenen zelfadministrerend dieren in de loop van de zelftoediening zitting (Figuur 2B) . Figuur 1. Voorbeeld chromatogrammen. Een microliter van ethanol standaard of dialysaat monster werd geladen in een gas chromatograph flacon en geanalyseerd zoals beschreven in de tekst. A) Overlay pieken gegenereerd uit 2,5, 5,0 en 10 mM ethanol normen. B) Peak gegenereerd op basis van een dialysaat monster van een rat die zelf in te vullen ethanol heeft. Figuur 2. Grafische resultaten van voorbeeld experiment weergegeven in figuur 1. A) Ethanol standaardcurve. B) Tijdsverloop van dialysaat ethanol concentratie over een ethanol zelftoediening sessie. Hardware Parameter Start-up instelling Running instelling Resting instelling 8400 Bruker (Varian) Autosampler Injectiemodus SPME SPME n / a <tr> Oplosmiddel indringdiepte 0% 20% n / a Voorbeeld indringdiepte 20% 20% n / a Absorptie tijd 0,01 min 3 min n / a Desorptie tijd 19 min 1 min n / a Reinig modus oplosmiddel bron Ik Ik n / a Clean-modus adsorptie en desorptie tijd 0,01 min 0,01 min n / a Waterbad (heats autosampler) * 50 ° C 50 ° C Uit CP-3800 Varian gaschromatograaf Injector Oven </td> Vermogen oven Op Op Op Oventemperatuur 250 ° C 220 ° C 30 ° C Column Oven Stabilisatietijd 0,10 min 0,10 min 0.10min Temperatuur 65 ° C 65 ° C 30 ° C Kolom Mobiele fase debiet 8,5 ml / min 8,5 ml / min n / a Kolomdruk ~ 6 psi ~ 6 psi ≥ 0,1 psi FID detector Vermogen oven Op Op Op Temperatuur 220 ° C 220 ° C 120 ° C </tr> Elektronica Op Op Uit Tijdconstante Snel Snel Snel Reeks 11 11 11 Autozero Ja Ja Ja Tabel 2. Gaschromatograaf met vlamionisatiedetectie systeemparameters. Deze tabel toont de parameters voor de drie programma's gebruikt voor het bereiden (start-up instellingen), run (hardlopen instellingen) en onderhouden van het systeem, terwijl niet in gebruik is (rust-instellingen).