מעקב אחר רדוקטיביים ו חמצוני חצאי תגובות של Monooxygenase פלבין תלויי באמצעות הופסק-Flow spectrophotometry

1. הכנת מאגר אנאירובית הכן 1 ליטר של 100 חיץ אשלגן זרחתי מ"מ, pH 7.5. יוצקים 250 מ"ל של למאגר לתוך בקבוק של 500 מ"ל בוכנר עם בר ומערבבים. סוגרים את הבקבוק עם פקק גומי ומניחים אותו על הצלחת ומערבבים. חבר את צינור קצר הבקבוק לקו Schlenk. דגה חיץ תחת ואקום במשך 5 שעות בטמפרטורת החדר בהתרגשות. במהלך פרק זמן זה, בצע 5 סיבובים רצופים של ואקום degassing ו שטיפה עם ארגון כל שעה. לשטוף את הבקבוק עם ארגון למשך 10 שניות ונתק אותו סעפת ואקום. מניחים את הבקבוק בתוך תא הכפפות. להשאיר בקבוק פתוח בתא הכפפות לילה בהתרגשות נמרצת. 2. הסרת חמצן מערכת הופסק זרימה הכן 1 ליטר של אצטט M 0.1 נתרן, pH 5.0. יוצקים 125 מ"ל של חיץ זה לתוך בקבוק של 250 מ"ל בוכנר ולבצע צעדים 1.2-1.4. לשקול את 5מ"ג גלוקוז אוקסידאז של אספרגילוס ניז'ר ​​(181,300 U / g) ו 0.9 גרם גלוקוז באמצעות צינור 1.5 מ"ל ו -50 מ"ל Eppendorf צינור פלקון חרוטי, בהתאמה. מניחים את שתי מכולות לתוך תא הכפפות. לפרק גלוקוז אוקסידאז וגלוקוז ב 50 מ"ל של אצטט אנאירובי M 0.1 נתרן, pH 5.0 (ריכוזים סופיים של 18.13 U / מ"ל ​​ו 100 מ"מ בהתאמה). למלא את המאגר מזרקים עם פתרון זה (איור 1). ודא כי כונן שסתומים הם במצב "עומס" וממלאים את הכונן מזרקים (איור 1). סובבו את שסתום F כדי העמדה "כונן". לרוקן את המזרק לעצור על ידי לחיצה על ריק בתוכנה Pro-Data שליטה. דחוף את החיץ בין F מזרק הכונן דרך מעגל זרימה באופן ידני על ידי העלאת האיל הכונן המתאים. חזור על שלב זה עשר פעמים בסך הכל. בצעו את אותו תהליך עם שלושת מזרקים אחרים הכונן. לחכות שעה אחת. להחליף את הפתרון של מזרקים המאגר עם contai חיץ אותונינג גלוקוז אוקסידאז וגלוקוז. חזור על שלב 2.4. חזור על שלב 2.5 ולאפשר פתרון לעמוד במערכת זרימת לילה. לאחר הדגירה לילה, חזור על שלב 2.5. 3. הכנת מאגר חמצן רווי הכן 100 mM אשלגן זרחתי חיץ (pH 7.5) ויוצקים לתוך 50 מ"ל בקבוקון 50 מ"ל עם בר ומערבבים. כיסוי או בקבוקון עם פקק ויטון וחותמת אלומיניום ויטון. מניחים את הבקבוקון על הקרח. לטבול את המחט הארוכה מחובר מיכל המכיל 100% חמצן אל הפתרון. להוסיף עוד מחט קצרה דרך הפקק של בקבוקון כמו פורקן. הפתרון הבועה עם חמצן 100% במשך שעה 1 בהתרגשות. ראשית להסיר את המחט קצרה בקבוקון ולחכות 10 שניות לפני הוצאת המחט הארוכה. מניחים את הבקבוקון סגור בתא הכפפות. 4. הכנת פתרון NADPH לשקול את 1 מ"ג של NADPH על צינור 1.5 Eppendorf מ"ל ומניחים אנילא לתוך תא הכפפות. ממיסים את NADPH ב μL 300 מאגר אנאירובי 100 אשלגן זרחתי מ"מ, pH 7.5. הסר 30 μL של פתרון זה מתא הכפפות כדי לקבוע את ריכוז NADPH עם ספקטרופוטומטר (ε 340 ננומטר = 6270 M -1 ס"מ -1). 5. הסרת חמצן פתרון האנזים קח 400 μL של פתרון המניות האנזים מהמקפיא ו ההפשרה בתא הכפפות. פתרון המניות האנזים (360 מיקרומטר) הוכנה בעבר 100 חיץ אשלגן זרחתי מ"מ (pH 7.5) המכיל 100 מ"מ NaCl, ו קפוא בחנקן נוזלי. מעבירים את הפתרון האנזים לתוך בקבוקון 25 מ"ל עם בר התרגשות, מכסה בקבוקון עם פקק ויטון וחותמת אלומיניום ויטון ולהסיר מתא הכפפות. מניחים את הבקבוקון על קרח וחבר אותו לקו Schlenk על ידי החדרת מחט דרך פקק של הבקבוקון. דגה פתרון האנזים על ידי ביצוע 5 סבבים רצופים שללשאוב degassing ו שטיפה עם ארגון כל 20 דקות במשך שעה 1. לשטוף את הבקבוקון עם ארגון למשך 10 שניות ונתק אותו סעפת ואקום. מניחים את הבקבוקון על קרח בתוך תא הכפפות. 6. רדוקטיבי חצי התגובה: פלבין הפחתת ניטור הכן את מכשיר הפסיקה זרימת ואת תוכנת Pro-Data שליטה על מצב ערבוב אחד לאחר פרוטוקול של היצרן. הפעל את האמבטיה במים במחזור (15 ° C). הסר החמצן מהמים על ידי מבעבעים חנקן דרכו במשך 20 דקות. זה מונע זיהום חמצן דרך מעגל הזרימה. לשמור על הטמפרטורה של מזרקים כונן והתא תצפית על 15 מעלות צלזיוס על ידי חיבור אמבט מים הדיור של זרימה הפסיק לאמבטיה במחזור. בחלון לוח בקרה של Pro-תוכנה נתונים מערך בקרת photodiode בחר ההדק חיצוניים (כדי להפעיל את הפסיקה זרימת הפעולה), וכן Logarithmic מידה. הפעל את תוכנת Pro-Data הצופה ולהגדיר את הספרייה שבה את קבצי הנתונים יישמרו. להחליף את הפתרון של מזרקים מאגר C ו-F עם חיץ אנאירובי 100 אשלגן זרחתי מ"מ (pH 7.5). להפוך את C ו-F כדי שסתומים עמדה "כונן". לרוקן את המזרק לעצור על ידי לחיצה על ריק בתוכנה Pro-Data שליטה. לחצו על חוצץ משני מזרקים לנסוע דרך מעגל זרימה באופן ידני על ידי העלאת הכונן המתאים אייל חמש פעמים בסך הכל (לחץ על רוקן לפני כל תנועה של RAM). על מנת להבטיח כי גלוקוז אוקסידאז הוסר לחלוטין מעגל זרימה, ביצוע שלב 6.6 ארבע פעמים בסך הכל. לחץ על בסיסי בתוכנה Pro-Data שליטה. מערבבים 100 μL של פתרון המניות האנזים עם μL 1100 מאגר אנאירובי 100 אשלגן זרחתי מ"מ (הריכוז הסופי לאחר ערבוב בזרם הפסיקה של 15 מיקרומטר). להחליף את הפתרון של מאגר SYRאינגה F בתמיסת האנזים. סובבו את שסתום F כדי העמדה "כונן". לרוקן את המזרק לעצור על ידי לחיצה על ריק בתוכנה Pro-Data שליטה. דחוף את הפתרון האנזים מ F מזרק הכונן דרך מעגל זרימה באופן ידני על ידי העלאת האיל הכונן המתאים. לבצע שלוש פעמים בסך הכל. בתוכנה Pro-Data הבקרה, קבע את זמן רכישת עד 60 שניות. ודא כי שני מזרקים כונן מלאים פתרונות המתאימים שלהם אילים כונן נמצאים בקשר עם בוכנות המזרק הכונן. הפעל את שני שסתומי אל עמדת "כונן" ולחץ לרכוש תוכנת Pro-Data השליטה לבצע את הכונן. חזור על פעולה זו פעמיים נוספות כדי להשיג את הנתונים בשלושה עותקים. זה ספקטרום התשואות של הטופס חמצון של האנזים. שימוש בערך 452 ננומטר לקבל מהכוננים, לקבוע את ריכוז האנזים לפני ערבוב (ε 452 ננומטר = 13700 מ -1 ס"מ -1) ולהכין 4 מ"ל של solutio NADPHn 1.5 פי מרוכז יותר. להחליף את הפתרון של מאגר מזרק C פתרון NADPH ו ריקים ולמלא את המזרק להפסיק שלוש פעמים כמתואר 6.10. חזור על שלב 6.11. זה ספקטרום התשואות במהלך הירידה של האנזים. 7. חמצוני חצי התגובה: פלבין חמצון ניטור הכן את מכשיר הפסיקה זרימת ואת תוכנת Pro-Data שליטה על מצב ערבוב כפול בעקבות פרוטוקול של היצרן. חזור על שלבים 6.2-6.5. להחליף את הפתרון בארבעת מזרקים עם המאגר למאגר אנאירובי 100 אשלגן זרחתי מ"מ (pH 7.5). סובבו את שסתום F כדי העמדה "כונן". רוקן את המזרק לעצור על ידי לחיצה על ריק בתוכנה Pro-Data שליטה. דחוף את החיץ בין F כונן מזרק דרך מעגל זרימה באופן ידני על ידי העלאת האיל הכונן המתאים. לבצע שלב זה חמש פעמים בסך הכל עם מזרק כל הכונן. ביצוע שלב 7.3 ארבע פעמים טוטאל להסיר לחלוטין את תוכנו של מעגל הזרימה. לחץ Baseline בתוכנה Pro-Data שליטה. מערבבים 200 μL של פתרון המניות האנזים עם μL 1000 מאגר אנאירובי 100 אשלגן זרחתי מ"מ (הריכוז הסופי לאחר ערבוב בזרם הפסיקה של 15 מיקרומטר). להחליף את הפתרון של מזרק מאגר פתרון האנזים. סובבו את שסתום אל עמדת "כונן". לרוקן את המזרק לעצור על ידי לחיצה על ריק בתוכנה Pro-Data שליטה. דחוף את הפתרון האנזים מן המזרק הכונן דרך מעגל זרימה באופן ידני על ידי העלאת האיל הכונן המתאים. בצע פעולה זו שלוש פעמים בסך הכל. בתוכנה Pro-Data הבקרה, קבע את הזמן עיכוב של 0.5 וזמן רכישה של עד 60. להבטיח כי כל כונן מזרקים מלאים פתרונות המתאימים שלהם אילים כונן נמצאים בקשר עם בוכנות המזרק הכונן. הפעל את כל שסתומי אל עמדת "כונן" ולחץ לרכוש Pro-Datתוכנות שליטה לבצע את הכונן. חזור על פעולה זו פעמיים נוספות כדי להשיג את הנתונים בשלושה עותקים. זה ספקטרום התשואות של הטופס חמצון של האנזים. להחליף את הפתרון של מאגר מזרק B פתרון NADPH 1.5 פי מרוכז יותר מאשר פתרון האנזים מזרק א סובב את השסתום ב 'עמדה "כונן" וריק ולמלא את המזרק לעצור שלוש פעמים כמתואר 7.7. להחליף את הפתרון של מאגר מזרק C עם חיץ מחומצן. סובבו את שסתום C כדי העמדה "כונן" וריק ולמלא את המזרק לעצור שלוש פעמים כמתואר 7.7. בתוכנה Pro-Data הבקרה, קבע את הזמן עיכוב הרכישה ב 15 ו 900 S, בהתאמה. חזור על שלב 7.8. זה ספקטרום התשואות במהלך reoxidation של האנזים הקטינה באופן מלא. 8. ניתוח נתונים הפעל את תוכנת Pro-Data ממיר. לחץ על הסמל אפשרויות ובחר ב ProDataCSV. לפתוחהספרייה שבה את קבצי הנתונים נשמרו. גררו את הקבצים לחלון Pro-APL ממיר נתונים. הנתונים יישמרו באופן אוטומטי קבצי CSV בפורמט באותה ספרייה. לפתוח את הקבצים בפורמט CSV באמצעות Microsoft Excel (מיקרוסופט, ברדמונד, וושינגטון, ארה"ב). לנרמל את הבסיס של הפסיקה זרימה עקבות על ידי הפחתת ספיגת המקביל ב 700 ננומטר. לנתח את עקבות לתקן באמצעות KaleidaGraph (תוכנה סינרגיה, קריאה, הרשות הפלסטינית) על ידי התאמת העלילה של ספיגת מקסימלית המקביל לעומת הזמן לפונקציה המעריכית המתאימה. כפי שמוצג באיור 2 ב, ספיגת ב 452 ננומטר היה להתוות כפונקציה של הזמן על מנת לקבוע את שיעור הפחתת פלבין לאחר ערבוב האנזים NADPH במכשיר הפסיקה זרימת. במקרה זה, בכושר הטוב ביותר של הנתונים הושגו באמצעות משוואה מעריכית כפולה שיעורי 0.65 ו 0.23 s -1 חושבו בשלב הראשון והשני של ירידה, מילpectively. כדי לקבוע את קצב היווצרות ביניים C4a-hydroperoxyflavin ו reoxidation לאחר מגיבים עם חמצן האנזים מופחת, ניתחנו את פסק זרימה עקבות ב 380 ו 452 ננומטר, בהתאמה (איור 3 ב). באמצעות משוואה מעריכית אחת, חישבנו שיעורי 1.4 ו -1 של 0.006 עבור השלב הראשון והשני של חמצוני חצי תגובה, בהתאמה. 9. נציג תוצאות התוצאות של הניסויים המתוארים בסעיפים הקודמים להראות כיצד רדוקטיבי חצי התגובה של Sida F יכול להיות פיקוח על ידי מדידת השינויים ספיגת ב 452 ננומטר, אשר תואמות את השינויים במדינה חיזור של פלבין. שיעור של שלב זה ניתן לקבוע על ידי התאמת הנתונים למשוואה המתאים (איור 2: שלב 8.4). שיעור הפחתת לקבל (0.65 s -1) דומה לערך החתול k מחושב עםהמצב היציב ניסויים 2, טוען כי הפחתת שיעור, קביעת שלב של התגובה. ניצול של מצב ערבוב כפול של זרימה עצר, קצב חמצון ואת ביניים בתגובה וחצי זה ניתן לקבוע (איור 3: שלב 8.4). בתגובה catalyzed ידי Sida F, C4a-hydroperoxyflavin מזוהה בבירור (λ מקסימום של 380 ננומטר), ושיעור של היווצרות עששת ניתן לחשב. קצב איטי של reoxidation לקבל (0.006 s -1) מצביע על כך C4a-hydroperoxyflavin יציב מאוד בהעדר ornithine. 1. תוכנית מנגנון Sida F. טבעת isoallozaxine של cofactor FAD מוצג. פלבין חמצון (A) נקשר NADPH (ב ') מגיב ליצירת פלבין מופחת NADP + (ג). לאחר התגובה עם חמצן מחייב מולקולרית שלornithine, C4a-hydroperoxyflavin נוצר (ד '). זהו המין hydroxylating. לאחר hydroxylation של ornithine, hydroxyflavin (ה) חייב להיות מיובש כדי ליצור אנזים חמצון. NADP + נותר חייב לאורך כל מחזור קטליטי והוא המוצר האחרון להשתחרר (F). באיור 1. המכשיר הפסיק זרימה. א) תמונה של מרכיבי Photophysics יישומי SX20 הפסיק זרימת ספקטרופוטומטר. ב ') תמונה של יחידת טיפול המדגם. ג) תוכנית של מעגל זרימת במצב ערבוב כפול. איור 2. ירידה אנאירובית של Sida עם NADPH במכשיר הפסיק זרימה. א) שינויים ספקטרליות שנרשמו לאחר ערבוב כמויות שוות של 30 מיקרומטר Sida ו NADPH 45 מיקרומטר. קשת 1 (חמצון Sida) ואת ספקטרום האחרון (מופחת באופן מלא סידא) מסומן בכחול ואדום, בהתאמה. ב) ספיגת זכר ב 452 ננומטר שנרשמו כפונקציה של הזמן. איור 3. חמצון של Sida במכשיר הפסיק זרימה. א) שינויים ספקטרליות נרשם לאחר ערבוב כמויות שוות של Sida מופחת באופן מלא מאגר מחומצן. הריכוזים האחרונים היו 15 מיקרומטר Sida, 22.5 NADPH מיקרומטר, ו 0.95 חמצן מ"מ. קשת רשמה ב 0.034, 4.268, ו 727.494 של האנזים המתאים מופחת באופן מלא, C4a-hydroperoxyflavin ביניים (λ מקסימום של 380 ננומטר), ו – אנזים חמצון (λ מקסימום של 450 ננומטר), בהתאמה. ב) זכר ספיגת ב 382 ו 452 ננומטר רשמה כפונקציה של הזמן.