رصد انتقاصية ومؤكسد نصف ردود فعل من Monooxygenase فلافين التي تعتمد على استخدام توقف تدفق الطيفي
Summary
وصفنا استخدام أداة توقف تدفق للتحقيق في كل من الاختزالية والاكسدة نصف ردود فعل<em> الرشاشية الدخناء</em> حاملة الحديد A (سيدا)، والتي تعتمد على monooxygenase فلافين. نعرض ثم الأطياف المقابلة لالأنواع في رد فعل من سيدا، ونحن حساب ثوابت معدل لتشكيلها.
Abstract
الرشاشية الدخناء حاملة الحديد A (سيدا) هو monooxygenase FAD المحتوية على أن يحفز الهيدروكسيل من الأورنيثين في التركيب الحيوي من siderophores hydroxamate التي تعتبر ضرورية لالفوعة (على سبيل المثال ferricrocin أو N '، N "، N'''-triacetylfusarinine C) 1. ويمكن تقسيم رد فعل يحفزه سيدا إلى الاختزالية والأكسدة ردود الفعل نصف (مخطط 1). وفي التخفيض نصف رد فعل، يتم تقليل FAD تتأكسد منضما إلى سيدا و، بواسطة NADPH 2،3. وفي رد فعل الأكسدة نصف والعامل المساعد انخفاض يتفاعل مع الأوكسجين الجزيئي لتشكيل المتوسطة C4a-hydroperoxyflavin، والذي ينقل الأكسجين إلى ذرة الأورنيثين. هنا، ونحن تصف إجراء لقياس معدلات وكشف أشكال مختلفة من الأطياف سيدا باستخدام أداة توقف تدفق مثبتة في 1 علبة القفازات اللاهوائية. في صك توقف التدفق، كميات صغيرة من المواد الداخلة في التفاعل وبسرعة متفاوتة، وبعد أن تم إيقاف تدفق من قبل اله حقنة توقف (الشكل 1)، وتسجل التغيرات الطيفية من الحل وضعت في زنزانة الملاحظة مع مرور الوقت. في الجزء الأول من التجربة، وتبين لنا كيف يمكننا استخدام أداة توقف التدفق في وضع واحد، حيث يتم قياسها بشكل مباشر على تخفيض اللاهوائية من فلافين في وسيدا و بواسطة NADPH. نحن نستخدم ثم إعدادات خلط مزدوج حيث لا هوائيا اول خفض لسيدا و NADPH بواسطة لفترة محددة من الوقت في حلقة الشيخوخة، ومن ثم كان رد فعل مع الأكسجين الجزيئي في الخلية مراقبة (الشكل 1). من أجل تنفيذ هذه التجربة، ومخازن اللاهوائية ضرورية لأنه عندما يتم رصد سوى التخفيض نصف رد فعل، أي الأوكسجين في الحلول وتتفاعل مع العامل المساعد فلافين انخفاض وتشكيل وسيطة C4a-hydroperoxyflavin التي من شأنها أن تتحلل في نهاية المطاف العودة الى فلافين المؤكسد . فإن هذا لن تسمح للمستخدم لقياس بدقة معدلات انخفاض منذ لن يكون هناك دوران كامل للenzyme. عندما يجب أن تجرى حاليا دراسة الأكسدة نصف رد فعل يتم تخفيض الانزيم في غياب الأوكسجين بحيث يتم فقط لاحظت الخطوات بين الحد والأكسدة. واحد من المخازن المؤقتة المستخدمة في هذه التجربة هو الاوكسجين مشبعة حتى نتمكن من دراسة الأكسدة نصف رد فعل على تركيزات أعلى من الأوكسجين. هذه غالبا ما تكون الإجراءات المنفذة وعند دراسة إما الاختزالية أو مؤكسد نصف ردود فعل مع فلافين التي تحتوي على monooxygenases. مقياس الوقت من التجارب السابقة للحالة استقرار أداء مع التدفق توقف هو ميلي ثانية إلى ثانية، والتي تسمح بتحديد سعر الثوابت الجوهرية وكشف وتحديد وسيطة في رد فعل 4. ويمكن تطبيق الإجراءات المذكورة هنا لmonooxygenases فلافين التي تعتمد على الآخرين. 5،6
Protocol
Discussion
الإنزيمات التي تحفز تفاعلات الأكسدة والاختزال عادة ما تحتوي على العوامل المساعدة مثل وhemes flavins أن تخضع لتغييرات كبيرة خلال الامتصاصية دورة الحفاز. شكل المؤكسد للفلافين يقدم ماكسيما الامتصاصية في ~ 360 و 450 نانومتر، وعادة ما يتم رصد الحد من قبل بعد انخفاض الامتصاصية في 450 نانومتر 7. بشكل عام، وبعض السلع الوسيطة عابر موجودة ولكن شكل والاضمحلال بسرعة جدا بحيث لا يمكن قياسها في مطياف العادية. باستخدام Photophysics التطبيقية SX20 توقف تدفق طيفي (أو أدوات مماثلة)، فمن الممكن لقياس التغيرات الامتصاصية في مقياس الوقت ميلي ثانية واحدة (ميت مرة، 2 مللي ثانية). درس هنا نحن في الاختزالية والاكسدة نصف ردود فعل monooxygenase فلافين التي تعتمد على وسيدا و، نموذجا يحتذى. وتم تحديد سعر نقل هيدريد عن طريق قياس التغير في الامتصاصية في 452 نانومتر بعد خلط انزيم مع NADPH في الظروف اللاهوائية. في وقت لاحق، مع الميزهوكان (ه) من وضع خلط مزدوج وثيقة وقف التدفق، كان رد فعل لأول مرة انزيم مع NADPH، حتى تم تحقيق تخفيض كامل، ثم كانت مختلطة في خفض انزيم NADP + مجمع مع الأكسجين. بعد هذا الإجراء، فإنه من الممكن الكشف عن عابر وسيطة فلافين الاوكسيجين وقياس معدلات تكوين والاضمحلال. وتحديد هذه السلع الوسيطة توفر البيانات التجريبية حول طبيعة هذا النوع رد فعل في الحفز. في حالة وجود سيدا و، تشكيل C4a-hydroperoxyflavin (رصدها عادة في 370-380 نانومتر)، والذي هو نوع hydroxylating. وبالإضافة إلى ذلك، وقياس معدل ثابت من كل خطوة واحد يسمح للحصول على معلومات عن خطوة تحديد سعر للتفاعل ويساعد على إلقاء الضوء على آليات الحركية والكيميائية للانزيم.
بشكل عام، يمكن استخدام نهج مماثل لflavoenzymes أخرى، أو البروتينات التي الامتصاصية التغييرات التي حدثت، مثل البروتينات التي تابععين الهيم، بيريدكسال فوسفات، أو غير هيم الحديد 8-10. وجود قيود على هذا الأسلوب هو أن هناك حاجة إلى كميات كبيرة من انزيم المنقى، ولكن يمكن التغلب على ذلك عن طريق استخدام نظام التعبير ذات العوائد المرتفعة. واحد يحدد تركيز بروتين الأمثل لأطياف تسجيل عن طريق استخدام ما يكفي من البروتين بحيث يمكن ملاحظة إشارة قوية بما فيه الكفاية، ولكن ليس كثيرا حتى لا يضيع هذا الانزيم. عادة، فإن أقل تركيز انزيم لفلافين التي تحتوي على الانزيمات المستخدمة في توقف تدفق التجارب هو 6-10 ميكرومتر (بعد خلط) ويتم تحديده باستخدام المقابلة معامل الانقراض ضرس من الانزيم. في حالة وجود سيدا و، النسبة المئوية للFAD انزيم ملزمة هو 50-65٪ 2. ويعتبر الاشتقاق بروتين كما نشط في هذه التجارب لأن العامل المساعد FAD المنضم هو ضروري لالحفز. ومن أوجه القصور الممكنة لهذا الأسلوب هو في حالة العمليات في انزيم يحدث بشكل أسرع من 2 مللي ثانية (الوقت الميت من التدفق توقف) لن يكون لاحظوا، ولكن الوتفيد التقارير يحرث الاستراتيجيات التي يمكن أن انخفضت معدلات للتغلب على هذه المشكلة. مثال واحد لهذا يتضمن استخدام تركيزات عالية كلوريد الصوديوم في رد فعل على اختزال + NADP فيريدوكسين-11. لتنقية الأكسجين من الدائرة تدفق تدفق توقفت في كثير من الأحيان خطوة صعبة في هذه التجربة وتتطلب اهتماما خاصا. يستخدم الجلوكوز أوكسيديز الجلوكوز، نظام الموصوفة هنا بنجاح في معظم المختبرات كما هو وسيلة فعالة وغير مكلفة. ومع ذلك، هناك بعض السلبيات التي تشمل إنتاج H 2 O 2 وبالنسبة لبعض التطبيقات وينبغي النظر في بدائل أخرى مثل نظام دي أكسيجيناز-protocatechuate protocatechuate 12. الاستفادة من علبة القفازات اللاهوائية يجعل من الاسهل لضمان الظروف اللاهوائية، ولكن ليس ضروريا. ويجب إزالة الأكسجين من دائرة تدفق تدفق توقف لاننا نريد ان يتم تخفيض الانزيم في غياب الأكسجين أو تتفاعل مع الأكسجين في تركيزق الذي نحدده نحن. وعلى الرغم من توقف التدفق هو في علبة القفازات، وهناك أكسجين في دائرة تدفق إذا كنا مخازن الهوائية في التجارب السابقة. بالإضافة إلى قياسات الامتصاصية، يمكن تنفيذ المقايسات ازدواج اللون مضان والتعميم في معمل توقف تدفق للPhotophysics التطبيقية SX20 مع الملحقات ذات الصلة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
البحثية التي تدعمها جائزة جبهة الخلاص الوطني MCB-1021384.
Materials
| General Laboratory Equipment | Company | Catalogue Number |
| Vacuum pump | Welch | – |
| Büchner flasks | Fisher | 70340-500 |
| Stir bars | Fisher | 14-512-129 |
| Stir plates | Fisher | 11-100-49S |
| Schlenk lines | Kontes Glass | – |
| Argon tank | Airgas | AR UPC300 |
| Nitrogen tank | Airgas | NI200 |
| Nitrogen tank, ultra high purity grade | Airgas | NI UHP200 |
| Oxygen tank | Airgas | OX 40 |
| 5% Hydrogen balance nitrogen tank | Airgas | X02NI95B200H998 |
| SX20 Stopped-flow spectrophotometer | AppliedPhotophysics | – |
| Glove box | Coy | – |
| Water bath | Brinkmann Lauda | – |
| Supplies | ||
| 50 mL BD Falcon tubes | Fisher | 14-432-23 |
| 15 mL BD Falcon conical tubes | Fisher | 05-527-90 |
| 1.5 mL Eppendorf microcentrifuge tubes | Fisher | 05-402-18 |
| 50 and 25 mL glass vials | Fisher | 06-402 |
| Rubber stoppers | Fisher | 06-447H |
| Aluminum seals | Fisher | 06-406-15 |
| Reagents | ||
| Potassium phosphate, monobasic | Fisher | AC2714080025 |
| Potassium phosphate, dibasic | Fisher | P288-500 |
| Sodium acetate | Sigma | S-2889 |
| Glucose oxidase from A. niger | Sigma | G7141-250KU |
| D-Glucose | Fisher | D16-500 |
| β-NADPH | Fisher | ICN10116783 |
| L(+)-Ornithine hydrochloride | Fisher | ICN10116783 |
References
- Hissen, A. H. The Aspergillus fumigatus siderophore biosynthetic gene sidA, encoding L-ornithine N5-oxygenase, is required for virulence. Infect. Immun. 73 (9), 5493-5503 (2005).
- Chocklett, S. W., Sobrado, P. Aspergillus fumigatus SidA is a highly specific ornithine hydroxylase with bound flavin cofactor. Biochemistry. 49 (31), 6777-6783 (2010).
- Mayfield, J. A. Comprehensive spectroscopic, steady state, and transient kinetic studies of a representative siderophore-associated flavin monooxygenase. J. Biol. Chem. 285 (40), 30375-30388 (2010).
- Fierke, C. A., Hammes, G. G. Transient kinetic approaches to enzyme mechanisms. Contemporary enzyme kinetics and mechanism. , (2009).
- Palfey, B. A., McDonald, C. A. Control of catalysis in flavin-dependent monooxygenases. Arch. Biochem. Biophys. 493 (1), 26-26 (2010).
- van Berkel, W. J. H., Kamerbeek, N. M., Fraaije, M. W. Flavoprotein monooxygenases, a diverse class of oxidative biocatalysts. J. Biotechnol. 124 (4), 670-689 (2006).
- Chapman, S. K., Reid, G. A. . Flavoprotein Protocols. , (1999).
- Sobrado, P., Fitzpatrick, P. F. Solvent and primary deuterium isotope effects show that lactate CH and OH bond cleavage are concerted in Y254F flavocytochrome b2, consistent with a hydride transfer mechanism. Biochemistry. 42, 15208-15214 (2003).
- Kumar, S., Gawandi, V. B., Capito, N., Phillips, R. S. Substituent effects on the reaction of β-benzoylalanines with Pseudomonas fluorescens kynureninase. Biochemistry. 49 (36), 7909-7913 (2010).
- Yun, D., García-Serres, R., Chicalese, B. M., An, Y. H., Huynh, B. H., Bollinger, J. M. J. (μ-1,2-Peroxo)diiron(III/III) complex as a precursor to the diiron(III/IV) intermediate X in the assembly of the iron-radical cofactor of ribonucleotide reductase from mouse. Biochemistry. 46 (7), 1925-1932 (2007).
- Pennati, A., Zanetti, G., Aliverti, A., Gadda, G. Effect of salt and pH on the reductive half-reaction of Mycobacterium tuberculosis FprA with NADPH Biochemistry. Biochemistry. 47 (11), 3418-3425 (2008).
- Patil, P. V., Allou, D. P. The use of protocatechuate dioxygenase for maintaining anaerobic conditions in biochemical experiments. Analytical Biochemistry. 286 (2), 187-192 (2000).
