Мониторинг восстановительной и окислительной Half-Реакции Флавин-зависимой монооксигеназной использованием Остановлено-Flow спектрофотометрии
Summary
Мы описываем использование остановил поток инструментом для исследования и восстановительного и окислительного половины реакций<em> Aspergillus фумигатус</em> Сидерофора (SIDA), флавин-зависимой монооксигеназной. Затем мы показываем, спектров, соответствующих видов реакции SIDA и вычислить константы скорости их образования.
Abstract
Aspergillus fumigatus siderophore A (SidA) is an FAD-containing monooxygenase that catalyzes the hydroxylation of ornithine in the biosynthesis of hydroxamate siderophores that are essential for virulence (e.g. ferricrocin or N‘,N“,N”’-triacetylfusarinine C)1. The reaction catalyzed by SidA can be divided into reductive and oxidative half-reactions (Scheme 1). In the reductive half-reaction, the oxidized FAD bound to Af SidA, is reduced by NADPH2,3. In the oxidative half-reaction, the reduced cofactor reacts with molecular oxygen to form a C4a-hydroperoxyflavin intermediate, which transfers an oxygen atom to ornithine. Here, we describe a procedure to measure the rates and detect the different spectral forms of SidA using a stopped-flow instrument installed in an anaerobic glove box. In the stopped-flow instrument, small volumes of reactants are rapidly mixed, and after the flow is stopped by the stop syringe (Figure 1), the spectral changes of the solution placed in the observation cell are recorded over time. In the first part of the experiment, we show how we can use the stopped-flow instrument in single mode, where the anaerobic reduction of the flavin in Af SidA by NADPH is directly measured. We then use double mixing settings where Af SidA is first anaerobically reduced by NADPH for a designated period of time in an aging loop, and then reacted with molecular oxygen in the observation cell (Figure 1). In order to perform this experiment, anaerobic buffers are necessary because when only the reductive half-reaction is monitored, any oxygen in the solutions will react with the reduced flavin cofactor and form a C4a-hydroperoxyflavin intermediate that will ultimately decay back into the oxidized flavin. This would not allow the user to accurately measure rates of reduction since there would be complete turnover of the enzyme. When the oxidative half-reaction is being studied the enzyme must be reduced in the absence of oxygen so that just the steps between reduction and oxidation are observed. One of the buffers used in this experiment is oxygen saturated so that we can study the oxidative half-reaction at higher concentrations of oxygen. These are often the procedures carried out when studying either the reductive or oxidative half-reactions with flavin-containing monooxygenases. The time scale of the pre-steady-state experiments performed with the stopped-flow is milliseconds to seconds, which allow the determination of intrinsic rate constants and the detection and identification of intermediates in the reaction4. The procedures described here can be applied to other flavin-dependent monooxygenases.5,6
Protocol
Discussion
Ферменты, которые катализируют окислительно-восстановительных реакций обычно содержат кофакторов, таких как гема и флавинов, которые подвергаются значительным изменениям абсорбции в ходе каталитического цикла. Окисленной формы флавин представляет поглощение максимума при ~ 360 и 450 нм, а его сокращение, как правило, контролируются после поглощения снижения при 450 нм 7. В общем, некоторые промежуточные переходные присутствуют, но форма и распад слишком быстро, чтобы быть измерена в обычных спектрофотометров. Использование прикладного Фотофизика SX20 остановил поток спектрофотометр (или аналогичные инструменты), то можно измерить абсорбцию изменения в масштабе времени миллисекунды (мертвое время, 2 мс). Здесь мы изучали восстановительного и окислительного половина реакции флавин-зависимой монооксигеназной е SIDA, выступающей в качестве модели. Скорость передачи гидрид было определено путем измерения изменения поглощения при 452 нм после смешивания ферментов с NADPH в анаэробных условиях. Впоследствии, принимая advantagе двойного смешивания режим остановил поток инструмент, фермент впервые взаимодействует с NADPH, до полного снижение было достигнуто, то снижение фермент НАДФ + комплекс в смеси с кислородом. После этой процедуры, можно обнаружить переходные кислородом промежуточных флавин и измерять скорости образования и распада. Идентификация этих промежуточных обеспечивает экспериментальные данные о природе реагирующих частиц в катализе. В случае е SIDA, формирование C4a-hydroperoxyflavin (как правило, контролируется на 370-380 нм), который является hydroxylating видов. Кроме того, измерения константы скорости каждым шагом позволяет получить информацию о лимитирующей стадии реакции и помочь выяснить кинетических и химических механизмов фермента.
В целом, аналогичные подходы могут быть использованы для других flavoenzymes, или белки, для которых поглощение произошли изменения, такие как белки, продолжениеАйн гема, пиридоксаль-фосфат, или негемового железа 8-10. Ограничение этого метода является то, что большое количество очищенных ферментов не требуется, но это можно преодолеть с помощью выражения системы с высокой урожайностью. Один определяет оптимальную концентрацию белка для регистрации спектров с помощью достаточно белка, так что достаточно сильный сигнал можно наблюдать, но не слишком много, так что фермент не зря. Как правило, самые низкие концентрации ферментов для флавин-содержащих ферментов, используемых в остановили поток экспериментов 6-10 мкм (после смешивания) и определяется с помощью соответствующего молярный коэффициент погашения фермента. В случае е SIDA, доля фермента связаны FAD является 50-65% 2. Апо-белков считается неактивным в этих экспериментах, так как связанные кофактора FAD необходимо для катализа. Другим возможным ограничением этого метода является то, если процессы в фермента происходит быстрее, чем 2 мс (мертвое время остановить поток), они не будут соблюдаться, но япрежде чем сообщается стратегии, где ставки могут быть снижены для преодоления этой проблемы. Одним из примеров этого включает в себя использование высоких концентраций NaCl в реакции ферредоксин-НАДФ +-редуктазы 11. Очистка кислорода из потока цепи остановился поток часто является хитрый шаг в этом эксперименте и требует особого внимания. Глюкозооксидазы глюкозы система, описываемая здесь успешно используется в большинстве лабораторий, как это эффективный и недорогой метод. Тем не менее, есть некоторые недостатки, которые включают производство H 2 O 2, а для некоторых приложений других вариантов, как protocatechuate dioxygenase-protocatechuate система должна рассматриваться 12. Использование анаэробных перчаточный ящик позволяет легко обеспечить анаэробные условия, но не является существенным. Кислород должен быть удален из потока цепи остановил поток, как мы хотим, чтобы фермент должны быть сокращены в отсутствие кислорода или вступать в реакцию с кислородом в концентрациис, что мы указываем. Несмотря на то, остановил поток находится в перчаточном ящике, есть кислород в циркуляционный контур если бы мы использовали аэробных буфера в предыдущих экспериментах. В дополнение к поглощению измерения флуоресценции и кругового дихроизма анализов может быть выполнена в прикладной Фотофизика SX20 остановил поток спектрофотометр с соответствующими аксессуарами.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Работа поддержана NSF награду MCB-1021384.
Materials
| General Laboratory Equipment | Company | Catalogue Number |
| Vacuum pump | Welch | – |
| Büchner flasks | Fisher | 70340-500 |
| Stir bars | Fisher | 14-512-129 |
| Stir plates | Fisher | 11-100-49S |
| Schlenk lines | Kontes Glass | – |
| Argon tank | Airgas | AR UPC300 |
| Nitrogen tank | Airgas | NI200 |
| Nitrogen tank, ultra high purity grade | Airgas | NI UHP200 |
| Oxygen tank | Airgas | OX 40 |
| 5% Hydrogen balance nitrogen tank | Airgas | X02NI95B200H998 |
| SX20 Stopped-flow spectrophotometer | AppliedPhotophysics | – |
| Glove box | Coy | – |
| Water bath | Brinkmann Lauda | – |
| Supplies | ||
| 50 mL BD Falcon tubes | Fisher | 14-432-23 |
| 15 mL BD Falcon conical tubes | Fisher | 05-527-90 |
| 1.5 mL Eppendorf microcentrifuge tubes | Fisher | 05-402-18 |
| 50 and 25 mL glass vials | Fisher | 06-402 |
| Rubber stoppers | Fisher | 06-447H |
| Aluminum seals | Fisher | 06-406-15 |
| Reagents | ||
| Potassium phosphate, monobasic | Fisher | AC2714080025 |
| Potassium phosphate, dibasic | Fisher | P288-500 |
| Sodium acetate | Sigma | S-2889 |
| Glucose oxidase from A. niger | Sigma | G7141-250KU |
| D-Glucose | Fisher | D16-500 |
| β-NADPH | Fisher | ICN10116783 |
| L(+)-Ornithine hydrochloride | Fisher | ICN10116783 |
References
- Hissen, A. H. The Aspergillus fumigatus siderophore biosynthetic gene sidA, encoding L-ornithine N5-oxygenase, is required for virulence. Infect. Immun. 73 (9), 5493-5503 (2005).
- Chocklett, S. W., Sobrado, P. Aspergillus fumigatus SidA is a highly specific ornithine hydroxylase with bound flavin cofactor. Biochemistry. 49 (31), 6777-6783 (2010).
- Mayfield, J. A. Comprehensive spectroscopic, steady state, and transient kinetic studies of a representative siderophore-associated flavin monooxygenase. J. Biol. Chem. 285 (40), 30375-30388 (2010).
- Fierke, C. A., Hammes, G. G. Transient kinetic approaches to enzyme mechanisms. Contemporary enzyme kinetics and mechanism. , (2009).
- Palfey, B. A., McDonald, C. A. Control of catalysis in flavin-dependent monooxygenases. Arch. Biochem. Biophys. 493 (1), 26-26 (2010).
- van Berkel, W. J. H., Kamerbeek, N. M., Fraaije, M. W. Flavoprotein monooxygenases, a diverse class of oxidative biocatalysts. J. Biotechnol. 124 (4), 670-689 (2006).
- Chapman, S. K., Reid, G. A. . Flavoprotein Protocols. , (1999).
- Sobrado, P., Fitzpatrick, P. F. Solvent and primary deuterium isotope effects show that lactate CH and OH bond cleavage are concerted in Y254F flavocytochrome b2, consistent with a hydride transfer mechanism. Biochemistry. 42, 15208-15214 (2003).
- Kumar, S., Gawandi, V. B., Capito, N., Phillips, R. S. Substituent effects on the reaction of β-benzoylalanines with Pseudomonas fluorescens kynureninase. Biochemistry. 49 (36), 7909-7913 (2010).
- Yun, D., García-Serres, R., Chicalese, B. M., An, Y. H., Huynh, B. H., Bollinger, J. M. J. (μ-1,2-Peroxo)diiron(III/III) complex as a precursor to the diiron(III/IV) intermediate X in the assembly of the iron-radical cofactor of ribonucleotide reductase from mouse. Biochemistry. 46 (7), 1925-1932 (2007).
- Pennati, A., Zanetti, G., Aliverti, A., Gadda, G. Effect of salt and pH on the reductive half-reaction of Mycobacterium tuberculosis FprA with NADPH Biochemistry. Biochemistry. 47 (11), 3418-3425 (2008).
- Patil, P. V., Allou, D. P. The use of protocatechuate dioxygenase for maintaining anaerobic conditions in biochemical experiments. Analytical Biochemistry. 286 (2), 187-192 (2000).
