Monitoraggio dei riduttivo e ossidativa semireazioni di Flavin-Dependent monoossigenasi con Stopped-Flow Spettrofotometria
Summary
Si descrivono l'uso di un stopped-flow strumento per studiare sia riduttive e ossidativo semireazioni di<em> Aspergillus fumigatus</em> Sideroforo A (Sida), un flavina-dipendente monoossigenasi. Abbiamo poi mostrano gli spettri corrispondenti alle specie di cui la reazione di Sida e calcolare le costanti di velocità per la loro formazione.
Abstract
Aspergillus fumigatus sideroforo A (Sida) è una monoossigenasi contenente FAD che catalizza l'idrossilazione della ornitina nella biosintesi di siderofori idrossamato che sono essenziali per la virulenza (ad es ferricrocin o N ', N ", N'''-triacetylfusarinine C) 1. La reazione catalizzata da Sida può essere divisa in riduttive e ossidativo semireazioni (Schema 1). Nella riduttiva semi-reazione, la FAD legato ossidato Sida A f, è ridotta NADPH 2,3. Nella ossidativo semireazione , il cofattore ridotta reagisce con l'ossigeno molecolare per formare un C4a-hydroperoxyflavin intermedio, che trasferisce un atomo di ossigeno per ornitina. Qui, si descrive un procedimento per misurare le tariffe e rilevare le forme spettrali differenti di Sida utilizzando un stopped-flow strumento installato uno glove box anaerobico. Nel stopped-flow strumento, piccoli volumi di reagenti sono rapidamente mista, e dopo che il flusso viene interrotto da thsiringa e arresto (figura 1), le variazioni spettrali della soluzione posta nella cella di osservazione sono registrate nel tempo. Nella prima parte dell'esperimento, si mostra come possiamo usare il stopped-flow strumento in modalità singola, in cui la riduzione anaerobica della flavina in A Sida f da NADPH viene misurata direttamente. Abbiamo quindi utilizzare doppie impostazioni di miscelazione dove A Sida f è prima anaerobicamente ridotto di NADPH per un determinato periodo di tempo in un ciclo di invecchiamento, e poi fatto reagire con ossigeno molecolare in cella di osservazione (Figura 1). Per eseguire questo esperimento, buffer anaerobiche sono necessari perché quando solo la metà riduttiva reazione viene controllata, l'ossigeno nelle soluzioni reagirà con il cofattore ridotta flavina e formano un C4a-hydroperoxyflavin intermedio che infine decadono indietro nel ossidato flavina . Ciò non consente all'utente di misurare accuratamente tassi di riduzione poiché non vi sarebbe turnover completa del EnzYME. Quando il ossidativo semireazione viene studiato l'enzima deve essere ridotto in assenza di ossigeno in modo che solo le passi tra riduzione e ossidazione sono osservati. Uno dei buffer utilizzati in questo esperimento è saturo di ossigeno in modo da poter studiare la ossidativo semi-reazione a concentrazioni più elevate di ossigeno. Questi sono spesso le procedure eseguite quando si studia sia le ossidativi o riduttivi semireazioni con flavina contenenti monossigenasi. La scala di tempo dei pre-steady state sperimentazioni condotte con la stopped-flow è millisecondi a secondi, che consentono la determinazione di costanti di velocità intrinseche e il rilevamento e l'identificazione di intermedi nella reazione 4. Le procedure qui descritte possono essere applicate ad altri flavina-dipendenti monossigenasi. 5,6
Protocol
Discussion
Enzimi che catalizzano reazioni redox solito contengono cofattori quali hemes e flavine che subiscono variazioni di assorbanza significativi durante il ciclo catalitico. La forma ossidata del flavina presenta assorbanza massimi a ~ 360 e 450 nm, e la sua riduzione è tipicamente monitorata seguendo la diminuzione di assorbanza a 450 nm 7. In generale, alcuni transitori intermedi sono presenti, ma la forma e il decadimento troppo veloce per essere misurato in spettrofotometri regolari. Utilizzando il Applied Photophysics SX20 stopped-flow spettrofotometro (o strumenti simili), è possibile misurare le variazioni di assorbanza nella scala temporale millisecondo (tempo morto, 2 ms). Qui abbiamo studiato le riduttive e ossidativo mezze reazioni del flavina-dipendente monooxygenase A Sida f, che funge da modello. Il tasso di trasferimento di idruro è stata determinata misurando la variazione di assorbanza a 452 nm dopo la miscelazione con l'enzima NADPH in condizioni anaerobiche. Successivamente, tenendo advantage della modalità doppia miscelazione del stopped-flow strumento, l'enzima è stato fatto reagire con NADPH, fino a completa riduzione è stata ottenuta, quindi il enzimatica ridotta-NADP + complesso è stato miscelato con ossigeno. Seguendo questa procedura, è possibile rilevare transitori intermedi flavina ossigenati e per misurare i tassi di formazione e di decadimento. L'identificazione di questi intermedi fornisce dati sperimentali sulla natura delle specie reattive di catalisi. Nel caso di Sida A f, la formazione del C4a-hydroperoxyflavin (tipicamente monitorato a 370-380 nm), che è la specie idrossilante. Inoltre, misurando la velocità costante di ogni passo permette di ottenere informazioni sul fattore limitante della reazione e aiutano a chiarire i meccanismi cinetici e chimico dell'enzima.
In generale, gli approcci simili possono essere usati per altre flavoenzymes, o proteine per le quali assorbanza cambiamenti intercorsi, come proteine che contain eme, piridossal-fosfato, o di ferro non-eme 8-10. Una limitazione di questo metodo è che grandi quantità di enzima purificato sono richiesti, ma questo può essere superato utilizzando un sistema di espressione con alte rese. Si determina la concentrazione proteica ottimale per spettri registrazione utilizzando proteine abbastanza così che un segnale sufficientemente forte può essere osservato, ma non troppo enzima che non viene sprecato. Tipicamente, la concentrazione più bassa enzima per flavina contenenti enzimi utilizzati in stopped-flow esperimenti è 6-10 uM (dopo la miscelazione) e viene determinata utilizzando il coefficiente di estinzione molare corrispondente dell'enzima. Nel caso di Sida A f, la percentuale di FAD enzima legato è 50-65% 2. Apo-proteina è considerata inattiva in questi esperimenti perché un cofattore FAD legato è necessaria per la catalisi. Un'altra possibile limitazione di questo metodo è se i processi in un enzima avvenire più velocemente di 2 ms (tempo morto di stopped-flow) che non verrà osservato, ma there sono riportate le strategie in cui i tassi può essere diminuita per superare questo problema. Un esempio di questo include l'utilizzo di una elevata concentrazione di NaCl nella reazione di ferredossina-NADP + riduttasi 11. Il lavaggio di ossigeno dal circuito flusso del stopped-flow è spesso un passo difficile in questo esperimento e richiede una particolare attenzione. La glucosio ossidasi-glucosio sistema qui descritto viene utilizzato con successo nella maggior parte dei laboratori in quanto è un metodo efficace ed economico. Tuttavia, ci sono alcuni svantaggi che includono la produzione di H 2 O 2 e per alcune applicazioni alternative come protocatechuate-diossigenasi protocatechuate sistema deve essere considerato 12. L'utilizzo di un glove box anaerobico rende più facile assicurare condizioni anaerobiche, ma non è essenziale. Ossigeno deve essere rimosso dal circuito di flusso del stopped-flow, come si vuole l'enzima di ridurre in assenza di ossigeno o di reagire con ossigeno a concentraziones che abbiamo specificato. Sebbene il stopped-flow è nel vano portaoggetti, vi è ossigeno nel circuito di flusso se usato buffer aerobiche in esperimenti precedenti. Oltre alle misurazioni di assorbanza, saggi di dicroismo circolare e fluorescenza può essere eseguita in Applied Photophysics SX20 stopped-flow spettrofotometro con relativi accessori.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La ricerca finanziata dalla NSF award MCB-1021384.
Materials
| General Laboratory Equipment | Company | Catalogue Number |
| Vacuum pump | Welch | – |
| Büchner flasks | Fisher | 70340-500 |
| Stir bars | Fisher | 14-512-129 |
| Stir plates | Fisher | 11-100-49S |
| Schlenk lines | Kontes Glass | – |
| Argon tank | Airgas | AR UPC300 |
| Nitrogen tank | Airgas | NI200 |
| Nitrogen tank, ultra high purity grade | Airgas | NI UHP200 |
| Oxygen tank | Airgas | OX 40 |
| 5% Hydrogen balance nitrogen tank | Airgas | X02NI95B200H998 |
| SX20 Stopped-flow spectrophotometer | AppliedPhotophysics | – |
| Glove box | Coy | – |
| Water bath | Brinkmann Lauda | – |
| Supplies | ||
| 50 mL BD Falcon tubes | Fisher | 14-432-23 |
| 15 mL BD Falcon conical tubes | Fisher | 05-527-90 |
| 1.5 mL Eppendorf microcentrifuge tubes | Fisher | 05-402-18 |
| 50 and 25 mL glass vials | Fisher | 06-402 |
| Rubber stoppers | Fisher | 06-447H |
| Aluminum seals | Fisher | 06-406-15 |
| Reagents | ||
| Potassium phosphate, monobasic | Fisher | AC2714080025 |
| Potassium phosphate, dibasic | Fisher | P288-500 |
| Sodium acetate | Sigma | S-2889 |
| Glucose oxidase from A. niger | Sigma | G7141-250KU |
| D-Glucose | Fisher | D16-500 |
| β-NADPH | Fisher | ICN10116783 |
| L(+)-Ornithine hydrochloride | Fisher | ICN10116783 |
References
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