Toezicht op de reductieve en oxidatieve Half-reacties van een Flavin-afhankelijke mono-oxygenase met Gestopt-Flow Spectrofotometrie

1. Voorbereiding van Anaërobe Buffer Bereid een L 100 mM kaliumfosfaat buffer pH 7,5. Giet 250 ml van de buffer in een 500 ml-Büchner kolf met een roerstaafje. Sluit de kolf met een rubber stop en plaats deze op een roer plaat. Sluit de korte slang van de kolf van een Schlenk lijn. Ontgas de buffer onder vacuum gedurende 5 uren bij kamertemperatuur roeren. Gedurende deze periode, moet u 5 opeenvolgende rondes van vacuüm ontgassen en spoelen met argon elk uur. Spoel de kolf met argon gedurende 10 seconden en de stekker uit het vacuum spruitstuk. Plaats de kolf in het handschoenenkastje. Laat de kolf open in het handschoenenkastje 's nachts met een heftige bewegingen. 2. Het verwijderen van zuurstof uit de Gestopt-flow-systeem Bereid een L 0,1 M natriumacetaat, pH 5.0. Giet 125 ml van deze buffer in een 250 ml-Büchner kolf en voert u de stappen 1.2-1.4. Weeg 5mg glucose oxidase van Aspergillus niger (181.300 U / g) en 0,9 g glucose met een 1,5 mL Eppendorf buis en 50 ml Falcon buis konische respectievelijk. Plaats beide containers in het handschoenenkastje. Los glucoseoxidase en glucose in 50 ml anaerobe 0,1 M natriumacetaat, pH 5.0 (uiteindelijke concentratie van 18,13 U / ml en 100 mM, respectievelijk). Vul het reservoir spuiten met deze oplossing (figuur 1). Zorg ervoor dat de drive kleppen zijn in de "load"-stand en vul de drive spuiten (figuur 1). Draai de F afsluiter naar de "drive"-stand. Leeg de stop spuit door te klikken op Verwijder in het Pro-Data control software. Druk op de buffer van de aandrijving spuit F door de stroom circuit door handmatig het verhogen van het betreffende station ram. Herhaal stap tien keer in totaal. Voer dezelfde procedure uit met de andere drie rijden spuiten. Wacht een uur. Plaats de oplossing van het reservoir spuiten met dezelfde buffer containing glucoseoxidase en glucose. Herhaal stap 2.4. Herhaal stap 2.5 en laat de oplossing een nacht staan ​​in de stroom-systeem. Na een nacht incubatie, herhaal stap 2.5. 3. Voorbereiding van zuurstof verzadigde Buffer Bereid 100 mM kaliumfosfaat buffer (pH 7,5) en giet 50 ml in een 50 ml flesje met een roerstaaf. Cap de flacon met een Wheaton stop en een Wheaton aluminium verzegeling. Plaats de flacon op ijs. Dompel een lange naald aangesloten op een reservoir met 100% zuurstof in de oplossing. Plaats een andere korte naald door de stop van de flacon als een vent. Bubble de oplossing met 100% zuurstof gedurende 1 uur onder roeren. Verwijder eerst de korte naald uit de flacon en wacht 10 seconden voordat u de lange naald. Plaats de gesloten flacon in het handschoenenkastje. 4. Voorbereiding van NADPH Solution Weeg 1 mg van NADPH in een 1,5 ml Eppendorf buis en plaats it in het handschoenenkastje. Los het NADPH in 300 ul van anaërobe 100 mM kaliumfosfaat buffer pH 7,5. Verwijder 30 pi van deze oplossing uit de handschoenkast de NADPH concentratie te bepalen met een spectrofotometer (ε = 340 nm 6270 M-1 cm-1). 5. Verwijderen van zuurstof uit de enzymoplossing Neem 400 pl van enzym voorraad oplossing uit de vriezer en dooi in het handschoenenkastje. Het enzym stock oplossing (360 uM) werd geprepareerd in 100 mM kaliumfosfaat buffer (pH 7,5) bevattende 100 mM NaCl, en bevroren in vloeibare stikstof. Breng de enzym oplossing in een 25-ml flacon met een roerstaaf, klap op de vuurpijl de flacon met een Wheaton stop en een Wheaton aluminium verzegeling en te verwijderen uit het handschoenenkastje. Plaats de flacon op ijs en sluit deze aan op een Schlenk lijn door het inbrengen van een naald door de stop van de flacon. Ontgas de enzymoplossing door het uitvoeren van 5 opeenvolgende rondenvacuümontgassing en spoelen met argon om de 20 minuten gedurende 1 uur. Spoel de flacon met argon gedurende 10 seconden en de stekker uit het vacuum spruitstuk. Plaats de flacon op het ijs in het handschoenenkastje. 6. Reductieve Half-reactie: Monitoring Flavin Reduction Bereid de gestopte-flow instrument en de Pro-Data control software voor enkele mixing mode volgens het protocol van de fabrikant. Zet een circulerend waterbad (15 ° C). Verwijder zuurstof uit het water door stikstof door het gedurende 20 minuten. Dit voorkomt de zuurstof verontreiniging door de stroming circuit. Handhaaf de temperatuur van de schijf spuiten en waarneming cel bij 15 ° C door aansluiting van de waterbad behuizing van de gestopt-stroom naar de circulerende bad. In het Configuratiescherm van de Pro-Data control software select fotodiode array, externe trigger (in gestopt-flow werking te activeren), en Logarithmic schaal. Start de Pro-Data Viewer software en definieert u de map waar de bestanden worden opgeslagen. Plaats de oplossing van het reservoir spuiten C en F met anaërobe 100 mM kaliumfosfaat buffer (pH 7,5). Draai de C en F kleppen aan de "drive"-stand. Leeg de stop spuit door te klikken op Verwijder in het Pro-Data control software. Druk op de buffer van beide rijden spuiten door de stroom circuit door handmatig het verhogen van het betreffende station ram vijf keer in totaal (op Leeg voor elke beweging van de ram). Om dat glucoseoxidase volledig is verwijderd uit de stroom circuit voeren stap 6.6 vier keer in totaal. Klik op Baseline in de Pro-Data control software. Men mengt 100 pi enzym voorraadoplossing met 1100 pi anaerobe 100 mM kaliumfosfaat buffer (eindconcentratie na het mengen in gestopt stroming van 15 pM). Vervang de oplossing van het reservoir Syringe F met de enzymoplossing. Draai de F afsluiter naar de "drive"-stand. Leeg de stop spuit door te klikken op Verwijder in het Pro-Data control software. Duw het enzym oplossing van rijden spuit F door de stroom circuit door handmatig het verhogen van het betreffende station ram. Voer deze in totaal drie keer. In de Pro-Data control software, stelt de overname tot 60 s. Zorg ervoor dat beide rijden spuiten worden gevuld met de bijbehorende oplossingen en de drive rammen in contact komen met de drive spuit zuigers. Draai de beide kleppen aan de "drive"-stand en klik op verwerven in de Pro-Data control software om het station uit te voeren. Herhaal stap twee keer de gegevens in drievoud verkrijgen. Dit levert spectra van de geoxideerde vorm van het enzym. De 452 nm waarde bij de stations bepalen enzymconcentratie voor mengen (ε 452 nm = 13.700 M-1 cm-1) en 4 ml bereiden van NADPH solution 1,5-maal meer geconcentreerd. Vervang de oplossing van het reservoir spuit C met de NADPH oplossing en leeg en vul de halte spuit drie keer, zoals beschreven in 6.10. Herhaal stap 6.11. Dit levert spectra tijdens de reductie van het enzym. 7. Oxidatieve Half-reactie: Monitoring Flavin Oxidatie Bereid de gestopte-flow instrument en de Pro-Data control software voor dubbele mixing mode volgens het protocol van de fabrikant. Herhaal de stappen 6.2-6.5. Plaats de oplossing in de vier reservoir spuiten met anaerobe 100 mM kaliumfosfaat buffer (pH 7,5). Draai de F afsluiter naar de "drive"-positie. Leeg de halte spuit door te klikken op Verwijder in het Pro-Data control software. Druk op de buffer van de drive spuit F door de stroom circuit door handmatig het verhogen van het betreffende station ram. Voer deze stap vijf keer in totaal met elk station spuit. Voer stap 7.3 vier keer in Total volledig te verwijderen van de inhoud van de stroom circuit. Klik Baseline in de Pro-Data control software. Meng 200 pi enzym voorraadoplossing met 1000 pi anaerobe 100 mM kaliumfosfaat buffer (eindconcentratie na het mengen in gestopt stroming van 15 pM). Plaats de oplossing van het reservoir spuit A met de enzymoplossing. Draai de Een klep aan de "drive"-stand. Leeg de stop spuit door te klikken op Verwijder in het Pro-Data control software. Duw het enzym oplossing van rijden spuit A tot en met de stroom circuit door handmatig het verhogen van het betreffende station ram. Voer deze stap drie keer in totaal. In de Pro-Data control software, stelt u de vertragingstijd tot 0,5 s en acquisitie tot 60 s. Zorg ervoor dat alle aandrijving spuiten worden gevuld met de bijbehorende oplossingen en de drive rammen in contact komen met de drive spuit zuigers. Zet alle kleppen aan de "drive" positie en klik verwerven in de Pro-Dateen besturings-softwaremodule naar de schijf uit te voeren. Herhaal stap twee keer de gegevens in drievoud verkrijgen. Dit levert spectra van de geoxideerde vorm van het enzym. Vervang de oplossing van het reservoir spuit B met een NADPH-oplossing 1,5-maal meer geconcentreerd dan de enzym oplossing in spuit A. Draai de B-klep aan de "drive"-stand en leeg en vul de halte spuit drie keer, zoals beschreven in 7.7. Vervang de oplossing van het reservoir spuit C met zuurstofrijk buffer. Draai de C afsluiter naar de "drive"-stand en leeg en vul de halte spuit drie keer, zoals beschreven in 7.7. In de Pro-Data control software, stelt u de vertraging en acquisitietijd op 15 en 900 s, respectievelijk. Herhaal stap 7.8. Dit levert bij de reoxidatie spectra van de volledig gereduceerde enzym. 8. Data-analyse Start de Pro-Data converter software. Klik op het pictogram Opties en selecteer Opslaan in ProDataCSV. Opende map waar de bestanden zijn opgeslagen. Sleep de bestanden naar de EVC-Pro-Data converter venster. De gegevens worden automatisch opgeslagen als CSV-bestanden in dezelfde map. Open het CSV-formaat bestanden met behulp van Microsoft Excel (Microsoft, Redmond, WA, USA). Normaliseren de baseline van de gestopte-flow sporen door het aftrekken van de overeenkomstige absorptie bij 700 nm. Analyseer de gecorrigeerde sporen met behulp van KaleidaGraph (Synergy Software, Reading, PA) door het aanbrengen van de plot van de absorptie bij de overeenkomstige maximale tegen de tijd om de juiste exponentiële functie. Zoals getoond in figuur 2B, de absorptie bij 452 nm is uitgezet als functie van de tijd om de snelheid van flavine verlaging bepalen na het mengen van de enzym en in het NADPH gestopt-flow instrument. In dit geval is het meest geschikt van de gegevens verkregen met een dubbele exponentiële vergelijking en percentages van 0,65 en 0,23 s'1 berekend voor de eerste en tweede fase van de vermindering respectively. Om de snelheid waarmee de C4a-hydroperoxyflavin tussenproduct en de reoxidatie na reactie de verlaagde enzym met zuurstof bepalen werden de gestopt-flow sporen geanalyseerd bij 380 en 452 nm, respectievelijk (Figuur 3B). Met een exponentiële vergelijking wij percentages van 1,4 en 0,006 s -1 berekend voor de eerste en tweede stap van de oxidatieve halve reactie, respectievelijk. 9. Representatieve resultaten De resultaten van de experimenten beschreven in de vorige paragrafen tonen hoe de reductieve halve reactie van een f Sida kan worden gecontroleerd door meting van de veranderingen in de absorptie bij 452 nm, die overeenkomen met de veranderingen in de stand van de redox flavine. De snelheid van deze stap kan worden bepaald door het aanbrengen van de gegevens naar de geschikte vergelijking (figuur 2 stap 8.4). Het verkregen reductie (0,65 s'1) is gelijk aan de waarde k kat berekendsteady-state experimenten 2, suggereert dat de daling is het snelheidsbepalende stap van de reactie. Gebruikmakend van de dubbele mengen stand van de stopgezette-stroom, kan de snelheid van oxidatie en de tussenproducten in deze halve reactie te bepalen (Figuur 3; stap 8.4). In de reactie gekatalyseerd door A f SIDA, wordt C4a-hydroperoxyflavin duidelijk waargenomen (λ max 380 nm), en de snelheid van vorming en verval kan worden berekend. Het langzame tempo van de verkregen reoxidatie (0,006 s -1) geeft aan dat de C4a-hydroperoxyflavin is zeer stabiel in de afwezigheid van de ornithine. Schema 1. Mechanisme van een F Sida. De isoallozaxine ring van de FAD cofactor wordt weergegeven. De geoxideerde flavine (A) bindt aan NADPH (B) en reageert onder vorming verlaagd flavine en NADP + (C). Na reactie met moleculaire zuurstof en binding vanornithine, wordt C4a-hydroperoxyflavin gevormd (D). Dit is de hydroxylering soort. Na hydroxylering van ornithine, moet de hydroxyflavin (E) drogen van de geoxideerde enzyme. NADP + blijft gebonden in de katalytische cyclus en is het laatste product vrij te geven (F). Figuur 1. Gestopt-flow instrument. A) Afbeelding van de componenten van de Toegepaste Fotofysica SX20 gestopt-flow spectrofotometer. B) Foto van het monster-unit. C) Regeling van de stroom circuit in dubbele mixing mode. Figuur 2. Anaërobe reductie van Sida met NADPH in de gestopte-flow instrument. A) Spectrale veranderingen opgenomen na het mengen van gelijke volumes van 30 uM Sida en 45 uM NADPH. De eerste spectrum (geoxideerd SIDA) en laatste spectrum (volledig gereduceerde SidA) is gemarkeerd in blauw en rood, respectievelijk. B) Absorptie spoor bij 452 nm geregistreerd als functie van de tijd. Figuur 3. Oxidatie van Sida in de gestopte-flow instrument. A) opgenomen Spectrale veranderingen na het mengen van gelijke volumes van de volledig verminderd SIDA en zuurstofrijk buffer. De uiteindelijke concentraties waren 15 uM Sida, 22,5 uM NADPH, en 0,95 mM zuurstof. Het spectrum opgenomen in 0.034, 4.268 en 727.494 en overeenkomt met het volledig gereduceerde enzym, de C4a-hydroperoxyflavin tussenproduct (λ max 380 nm), en de geoxideerde enzym (λ max 450 nm), respectievelijk. B) Absorptie spoor op 382 en 452 nm geregistreerd als functie van de tijd.