Suivi des réduction et par oxydation demi-réactions d'une monooxygénase flavine-dépendante à l'aide Stopped-Flow Spectrophotométrie

1. Préparation du Tampon anaérobie Préparer 1 L de tampon phosphate 100 mM de potassium, pH 7,5. Verser 250 ml de tampon dans un flacon de 500 ml de Büchner avec un barreau aimanté. Sceller la fiole avec un bouchon en caoutchouc et placez-le sur une plaque d'agitation. Relier le tube court du ballon à une ligne de Schlenk. Degas le tampon sous vide pendant 5 heures à température ambiante sous agitation. Durant cette période, effectuer 5 tours consécutifs de dégazage sous vide et le rinçage avec de l'argon à chaque heure. Rincer le flacon avec de l'argon pendant 10 secondes et le débrancher de la chambre à vide. Placer le ballon à l'intérieur de la boîte à gants. Laissez le flacon ouvert dans la boîte à gants pendant la nuit avec une agitation vigoureuse. 2. Éliminer l'oxygène de l'arrêt du système d'écoulement Préparer 1 L de 0,1 M acétate de sodium, pH 5,0. Verser 125 ml de ce tampon dans un flacon de 250 ml de Büchner et effectuez les étapes 01.02 à 01.04. Peser 5mg de glucose oxydase à partir d'Aspergillus Niger (181 300 U / g) et 0,9 g de glucose utilisant une 1,5 ml Eppendorf tube et 50 ml Falcon conique du tube, respectivement. Placez les deux conteneurs dans la boîte à gants. Dissoudre la glucose oxydase et le glucose dans 50 ml d'acétate de sodium 0,1 anaérobie M, pH 5,0 (concentrations finales de 18,13 U / ml et 100 mm, respectivement). Remplir les seringues de réservoir avec cette solution (Figure 1). Assurez-vous que les vannes de commande sont dans le "charge" la position et de remplir les seringues d'entraînement (Figure 1). Tournez la vanne F de la "drive" la position. Vider la seringue arrêt en cliquant sur ​​Vider dans le logiciel de contrôle Pro-Data. Poussez la mémoire tampon de F seringue lecteur à travers le circuit d'écoulement manuellement élever le bélier lecteur correspondant. Répétez cette étape dix fois au total. Effectuez la même procédure avec les trois autres seringues entraînement. Attendre une heure. Remplacer la solution des seringues réservoir avec le même tampon CONTAINing glucose oxydase et de glucose. Répétez l'étape 2.4. Répétez l'étape 2.5 et permettre à la solution de se tenir dans le système d'écoulement durant la nuit. Après une nuit d'incubation, répétez l'étape 2.5. 3. Préparation du Tampon saturée en oxygène Préparer un tampon phosphate 100 mM de potassium (pH 7,5) et verser 50 ml dans un flacon de 50 ml avec un barreau aimanté. Boucher le flacon avec un bouchon Wheaton et un sceau d'aluminium Wheaton. Placez le flacon sur la glace. Immerger une longue aiguille reliée à un réservoir contenant de l'oxygène à 100% dans la solution. Insérez un autre aiguille courte à travers le bouchon du flacon comme un évent. Bubble la solution avec de l'oxygène à 100% pendant 1 heure avec agitation. Commencez par retirer l'aiguille courte dans le flacon et attendre 10 secondes avant de retirer l'aiguille longue. Placez le flacon fermé dans la boîte à gants. 4. Préparation de la solution de NADPH Peser à 1 mg de NADPH dans un tube Eppendorf de 1,5 ml et placer it dans la boîte à gants. Dissoudre le NADPH dans 300 pi de anaérobie tampon phosphate 100 mM de potassium, pH 7,5. Retirez 30 uL de cette solution de la boîte à gants pour déterminer la concentration de NADPH avec un spectrophotomètre (e = 340 nm 6270 M -1 cm -1). 5. Élimination de l'oxygène de la solution enzymatique Prendre 400 ul de la solution mère enzyme du congélateur et du dégel dans la boîte à gants. La solution stock enzyme (360 uM) a été préalablement préparé dans un tampon phosphate 100 mM de potassium (pH 7,5) contenant 100 mM de NaCl, et congelés dans l'azote liquide. Transférer la solution d'enzyme dans un flacon de 25 ml avec un barreau aimanté, plafonner le flacon avec un bouchon Wheaton et un sceau d'aluminium Wheaton et de retirer de la boîte à gants. Placez le flacon sur la glace et le connecter à une ligne de Schlenk en insérant une aiguille dans le bouchon du flacon. Degas la solution enzymatique en effectuant 5 tours consécutifs dedégazage sous vide et le rinçage avec de l'argon toutes les 20 minutes pendant 1 heure. Rincer le flacon avec de l'argon pendant 10 secondes et le débrancher de la chambre à vide. Placez le flacon sur la glace à l'intérieur de la boîte à gants. 6. Demi-réaction réductrice: la réduction de surveillance Flavin Préparation de l'instrument stopped-flow et le logiciel de contrôle Pro-Data pour le mode de mélange unique suivant le protocole du fabricant. Tourner sur un bain d'eau circulant (15 ° C). Éliminer l'oxygène de l'eau par barbotage d'azote pendant 20 minutes. Cela empêche la contamination par l'oxygène à travers le circuit d'écoulement. Maintenir la température des seringues d'entraînement et la cellule d'observation à 15 ° C en connectant le boîtier bain d'eau de l'arrêt d'écoulement dans le bain circulant. Dans la fenêtre Panneau de configuration de la baie de Pro-Data logiciels Photodiode de commande de sélection, de déclenchement externe (pour activer stopped-flow opération), et Logaritéchelle HMIC. Lancez le logiciel de visualisation de données Pro-et de définir le répertoire où les fichiers de données seront stockées. Remplacer la solution du réservoir seringues C et F avec anaérobie tampon phosphate 100 mM de potassium (pH 7,5). Tournez la C et F vannes à la "drive" la position. Vider la seringue arrêt en cliquant sur ​​Vider dans le logiciel de contrôle Pro-Data. Pousser le tampon de deux seringues d'entraînement par l'intermédiaire du circuit d'écoulement en manuellement élever le disque correspondant ram cinq fois au total (clique vide avant chaque déplacement du coulisseau). Afin d'assurer que la glucose oxydase a été entièrement enlevée du circuit d'écoulement, effectuer l'étape 6.6 quatre fois au total. Cliquez sur base du logiciel de contrôle Pro-Data. Mélanger 100 ul de la solution mère enzyme avec 1100 ul de anaérobie tampon phosphate 100 mM de potassium (concentration finale après mélange dans le flux arrêté de 15 uM). Remplacer la solution du réservoir syrF inge avec la solution d'enzyme. Tournez la vanne F de la "drive" la position. Vider la seringue arrêt en cliquant sur ​​Vider dans le logiciel de contrôle Pro-Data. Poussez la solution enzymatique à partir de F seringue d'entraînement à travers le circuit d'écoulement manuellement élever le bélier lecteur correspondant. Effectuez cette opération trois fois au total. Dans le logiciel de contrôle Pro-données, définissez le temps d'acquisition à 60 s. Faire en sorte que les deux seringues d'entraînement sont remplis avec les solutions correspondantes et l'entraînement béliers sont en contact avec les pistons de seringue d'entraînement. Tournez les deux vannes de la "drive" et cliquez sur la position dans l'acquisition du logiciel de commande Pro-Data pour effectuer le lecteur. Répétez cette étape deux fois plus pour obtenir les données en trois exemplaires. Ce spectres rendements de la forme oxydée de l'enzyme. Utilisation de la valeur de A 452 nm obtenue à partir des disques, de déterminer la concentration d'enzyme avant de les mélanger (e = 452 nm 13700 M -1 cm -1) et de préparer 4 ml d'une solutio NADPHn de 1,5 fois plus concentrée. Remplacer la solution de réservoir de seringue C avec la solution de NADPH et de vides et de remplissage de la seringue d'arrêt trois fois comme décrit dans 6,10. Répétez l'étape 6.11. Ce spectres rendements lors de la réduction de l'enzyme. 7. Oxydatif Demi-réaction: oxydation Flavin surveillance Préparation de l'instrument stopped-flow et le logiciel de contrôle Pro-Data pour le mode de mélange à double suivant le protocole du fabricant. Répétez les étapes 6,2-6,5. Remplacer la solution dans les quatre seringues réservoir avec anaérobie tampon phosphate 100 mM de potassium (pH 7,5). Tournez la vanne F de la "drive" la position. Vider la seringue arrêt en cliquant sur ​​Vider dans le logiciel de contrôle Pro-Data. Appuyez sur le tampon de la F seringue d'entraînement à travers le circuit d'écoulement manuellement élever le bélier lecteur correspondant. Effectuez cette étape cinq fois au total avec chaque seringue d'entraînement. Effectuez l'étape 7.3 à quatre reprises en total pour supprimer complètement le contenu du circuit d'écoulement. Cliquez référence dans le logiciel de contrôle Pro-Data. Mélanger 200 ul de la solution mère enzyme avec 1000 ul de anaérobie tampon phosphate 100 mM de potassium (concentration finale après mélange dans le flux arrêté de 15 uM). Remplacer la solution de la seringue réservoir A avec la solution d'enzyme. Tournez la vanne A de la "drive" la position. Vider la seringue arrêt en cliquant sur ​​Vider dans le logiciel de contrôle Pro-Data. Poussez la solution d'enzyme de la seringue le lecteur A travers le circuit d'écoulement manuellement élever le bélier lecteur correspondant. Effectuez cette étape trois fois au total. Dans le logiciel de contrôle Pro-Data, le temps de retard à 0,5 s et le temps d'acquisition à 60 s. Faire en sorte que toutes les seringues d'entraînement sont remplis avec les solutions correspondantes et l'entraînement béliers sont en contact avec les pistons de seringue d'entraînement. Tourner toutes les vannes de la "drive" et cliquez sur la position d'acquérir à l'Pro-Datun logiciel de commande pour effectuer l'entraînement. Répétez cette étape deux fois plus pour obtenir les données en trois exemplaires. Ce spectres rendements de la forme oxydée de l'enzyme. Remplacer la solution de la seringue réservoir B avec une solution de NADPH 1,5 fois plus concentrée que la solution d'enzyme dans la seringue A. Tournez la vanne B de la "drive" la position vide et de remplissage de la seringue arrêt trois fois comme décrit en 7.7. Remplacer la solution du réservoir seringue C avec un tampon oxygéné. Activer la soupape à l'C "d'entraînement" position et vide et de remplissage de la seringue d'arrêt trois fois comme décrit en 7.7. Dans le logiciel de contrôle Pro-Data, le temps de retard et de l'acquisition à 15 et 900 s, respectivement. Répétez l'étape 7.8. Ce spectres rendements au cours de la réoxydation de l'enzyme complètement réduit. 8. Analyse des données Lancez le logiciel de convertisseur de Pro-Data. Cliquez sur l'icône Options et sélectionnez Enregistrer dans ProDataCSV. Ouvertle répertoire où les fichiers de données ont été stockées. Faites glisser les fichiers dans la fenêtre de convertisseur de Pro-Data APL. Les données seront sauvegardées automatiquement sous forme de fichiers au format CSV dans le même répertoire. Ouvrez les fichiers au format CSV en utilisant Microsoft Excel (Microsoft, Redmond, WA, Etats-Unis). Normaliser la base des traces arrêté débit en soustrayant l'absorption correspondant à 700 nm. Analyser les traces corrigées à l'aide KaleidaGraph (Synergy Software, Reading, PA) en ajustant le terrain de l'absorbance au maximum en fonction du temps correspondant à la fonction appropriée exponentielle. Comme le montre la figure 2B, l'absorbance à 452 nm est tracée en fonction du temps afin de déterminer le taux de réduction de flavine après mélange l'enzyme NADPH et dans l'instrument arrêté-débit. Dans ce cas, le meilleur ajustement des données ont été obtenues en utilisant une double équation exponentielle et des taux de 0,65 et 0,23 s -1 ont été calculés pour la première et deuxième phases de la réduction, la chosepectivement. Pour déterminer le taux de formation de l'intermédiaire C4a-hydroperoxyflavin et la réoxydation après avoir fait réagir l'enzyme réduit avec de l'oxygène, nous avons analysé les traces stopped-flow à 380 et 452 nm, respectivement (figure 3B). En utilisant une équation unique exponentielle, on calcule les taux de 1,4 et 0,006 s -1 pendant la première étape et la deuxième de la demi-réaction d'oxydation, respectivement. 9. Les résultats représentatifs Les résultats des expériences décrites dans les sections précédentes montrent comment le réductrice demi-réaction de A f Sida peut être surveillée en mesurant les changements de l'absorbance à 452 nm, qui correspondent aux changements de l'état redox de la flavine. Le taux de cette étape peut être déterminée en ajustant les données de l'équation appropriée (Figure 2; étape 8.4). Le taux de réduction obtenu (0,65 s -1) est similaire à la valeur calculée avec k catl'état d'équilibre des expériences 2, suggérant que la réduction est le taux étape déterminante de la réaction. Profitant de la double mode de mélange de l'arrêté-débit, le taux d'oxydation et les intermédiaires dans cette demi-réaction peut être déterminée (figure 3; étape 8.4). Dans la réaction catalysée par l'ASDI A f, le C4a-hydroperoxyflavin est clairement détecté (λ max de 380 nm), et le taux de formation et la décomposition peut être calculée. La lenteur de la réoxydation obtenu (0,006 s -1) indique que le C4a-hydroperoxyflavin est très stable en l'absence de l'ornithine. Schéma 1. Mécanisme de A f Sida. L'anneau isoallozaxine du cofacteur FAD est montré. Le oxydé flavine (A) se lie à la NADPH (B) et réagit pour former réduite flavine et du NADP + (C). Après réaction avec l'oxygène moléculaire et de liaison deornithine, l'C4a-hydroperoxyflavin est formée (D). Ce sont les espèces hydroxylation. Après l'hydroxylation de l'ornithine, l'hydroxyflavin (E) doit être déshydratée pour former l'enzyme oxydée. NADP + reste lié tout au long du cycle catalytique et est le dernier produit à être libéré (F). Figure 1. L'instrument stopped-flow. A) Image des composants de la SX20 Applied Photophysics stopped-flow spectrophotomètre. B) Image de l'unité de traitement de l'échantillon. C) schéma du circuit d'écoulement en mode de mélange à double. Figure 2. La réduction anaérobie de Sida avec le NADPH dans l'instrument stopped-flow. Quelques changements Spectral) enregistrés après le mélange des volumes égaux de 30 uM Sida et 45 uM de NADPH. Le premier spectre (oxydé Sida) et le spectre dernière (entièrement réduite SidA) est surligné en bleu et rouge, respectivement. Trace absorbance B) à 452 nm enregistrées en tant que fonction du temps. Figure 3. Oxydation du Sida dans l'instrument stopped-flow. A) les modifications spectrales enregistrées après mélange des volumes égaux de l'Asdi et totalement réduit tampon oxygéné. Les concentrations finales étaient de 15 uM, l'Asdi 22,5 uM NADPH, d'oxygène et 0,95 mM. Le spectre enregistré à 0,034, 4,268, et 727.494 s correspond à l'enzyme complètement réduit, le produit intermédiaire C4a-hydroperoxyflavin (λ max de 380 nm), et l'enzyme oxydée (λ max de 450 nm), respectivement. B) trace l'absorbance à 382 et 452 nm enregistrée en fonction du temps.