Die Überwachung der reduktiven und oxidativen Halbreaktionen eines Flavin-abhängige Monooxygenase mit Stopped-Flow Spektrophotometrie
Summary
Wir beschreiben die Verwendung eines Stopped-Flow-Gerät sowohl die reduktive und oxidative Reaktionen von Halb-Untersuchung<em> Aspergillus fumigatus</em> Ein Siderophor (SIDA), eine Flavin-abhängige Monooxygenase. Wir stellen dann die Spektren entsprechend der Spezies in der Reaktion von Sida, und wir berechnen die Geschwindigkeitskonstanten für ihre Bildung.
Abstract
Aspergillus fumigatus Siderophor A (SIDA) ist ein FAD-haltige Monooxygenase, die die Hydroxylierung von Ornithin katalysiert in der Biosynthese von Hydroxamat Siderophore, die für Virulenz (zB ferricrocin oder N ', N ", N'''-triacetylfusarinine C) 1 sind. Die Reaktion von Sida katalysiert werden in reduktive und oxidative Halbreaktionen (Schema 1) unterteilt werden. Bei der reduktiven halbreaktion die oxidierte FAD gebunden an A f Sida, durch NADPH 2,3 reduziert wird. Bei der oxidativen halbreaktion die reduzierten Cofaktor reagiert mit molekularem Sauerstoff zu einem C4a-hydroperoxyflavin Zwischenschicht, die ein Sauerstoffatom überträgt Ornithin bilden. Hier haben wir ein Verfahren, um die zu messen und erkennen die verschiedenen spektralen Formen von Sida Verwendung eines Stopped-Flow-Gerät installiert beschreiben eine anaerobe Handschuhfach. In Stopped-Flow-Instrument, sind kleine Mengen der Reaktanten rasch gemischt, und nach der Strömung durch th gestoppte Anschlag Spritze (1), werden die spektralen Veränderungen der Lösung in der Zelle angeordnet Beobachtung über die Zeit aufgezeichnet. Im ersten Teil des Experiments zeigen wir, wie wir die Stopped-Flow-Instrument im Single-Modus, wo die anaerobe Reduktion des Flavin in a-f Sida durch NADPH direkt gemessen wird, zu verwenden. Wir verwenden dann doppelt Mischen Einstellungen in der A f Sida erste anaerob durch NADPH wird für eine bestimmte Zeit in einer alternden Schleife reduziert, und dann mit molekularem Sauerstoff in der Zelle Beobachtung (Abbildung 1). Um dieses Experiment durchzuführen, sind anaerobe Puffer erforderlich, weil, wenn nur die reduktive halbreaktion überwacht wird, kein Sauerstoff in den Lösungen mit der reduzierten Flavin reagieren und bilden eine C4a-hydroperoxyflavin Zwischenschicht, die letztlich zerfallen wieder in den oxidierten Flavin . Dies würde nicht zulassen, dass der Benutzer genau zu messen Ermäßigungssätze da komplette Umsatz der Enz wäreYme. Wenn die oxidative halbreaktion geprüft wird das Enzym muss in Abwesenheit von Sauerstoff, so dass nur die Schritte von Reduktion und Oxidation beobachtet reduziert werden. Einer der Puffer in diesem Experiment verwendet Sauerstoff gesättigt ist, so dass wir die oxidative halbreaktion bei höheren Konzentrationen von Sauerstoff zu studieren. Diese sind oft die durchgeführten Verfahren bei der Untersuchung entweder die reduktive oder oxidative Halbreaktionen mit Flavin-Monooxygenasen. Die Zeitskala der Pre-Steady-State-Experimente mit der Stopped-Flow durchgeführt ist Millisekunden bis Sekunden, die die Bestimmung der intrinsischen Geschwindigkeitskonstanten und die Detektion und Identifizierung von Zwischenstufen der Reaktion 4 zu ermöglichen. Die hier beschriebenen Verfahren kann auf andere Flavin-abhängigen Monooxygenasen angewendet werden. 5,6
Protocol
Discussion
Enzyme, die Redox-Reaktionen katalysieren, enthalten in der Regel Cofaktoren wie Häme und Flavine, die bedeutende Veränderungen erfahren Absorption während des Katalysezyklus. Die oxidierte Form des Flavin zeigt Absorptionsmaxima bei ~ 360 und 450 nm, und seine Reduktion wird typischerweise durch die Absorption nach Abnahme bei 450 nm 7 überwacht. Im Allgemeinen sind einige kurzlebige Zwischenstufen vorliegenden sondern bilden und Zerfall zu schnell, um in regelmäßigen Spektralphotometer gemessen werden. Verwendung des Applied Photophysik SX20 Stopped-Flow-Spektralphotometer (oder ähnliches), ist es möglich, Änderungen in der Extinktion Millisekundenbereich (Totzeit, 2 ms) zu messen. Hier untersuchten wir die reduktive und oxidative Halbreaktionen des Flavin-abhängige Monooxygenase A f Sida, als Modell. Die Geschwindigkeit der Hydrid wurde durch Messen der Veränderung der Absorption bei 452 nm nach dem Mischen des Enzyms mit NADPH unter anaeroben Bedingungen bestimmt. Anschließend, unter advantage der Doppel-Mischen-Modus der Stopped-Flow-Instrument, wurde das Enzym NADPH reagiert zunächst mit, bis zur vollständigen Reduktion wurde erreicht, dann ist die reduzierte Enzym-NADP +-Komplex wurde mit Sauerstoff gemischt. Nach diesem Verfahren ist es möglich, transiente Flavin oxygenierten Zwischenstufen zu erkennen und Raten von Bildung und Zerfall zu messen. Die Identifizierung dieser Zwischenprodukte bietet experimentellen Daten über die Art der reagierenden Spezies in der Katalyse. Im Fall von A f Sida, die Bildung des C4a-hydroperoxyflavin (typischerweise bei 370 bis 380 nm überwacht), die die Hydroxylierung von Spezies ist. Darüber hinaus Messen der konstanten jeder Stufe ermöglicht es, Informationen über die geschwindigkeitsbestimmende Schritt der Reaktion zu erhalten und dazu beitragen, die kinetischen und chemischen Mechanismen des Enzyms aufzuklären.
Im Allgemeinen können ähnliche Ansätze für andere Flavoenzyme oder Proteine, für die Absorption ändert aufgetreten sind, wie Proteine verwendet werden, dass contain Häm, Pyridoxal-Phosphat-oder Nicht-Häm-Eisen 8-10. Eine Einschränkung dieses Verfahrens besteht darin, dass große Mengen von gereinigtem Enzym benötigt werden, aber dies kann unter Verwendung eines Ausdrucks mit hohen Ausbeuten zu überwinden. Man bestimmt die optimale Protein-Konzentration für die Aufnahme von Spektren mit genügend Eiweiß, so dass ein Signal stark genug beobachtet werden kann, aber nicht zu viel, so dass Enzym wird nicht verschwendet. Typischerweise ist die niedrigste Enzymkonzentration für Flavin-Enzyme in Stopped-Flow-Experimenten verwendet 6-10 pM (nach dem Mischen) und wird unter Verwendung der entsprechenden molaren Extinktionskoeffizienten des Enzyms. Im Fall von A f Sida, ist der Prozentsatz des Enzyms gebunden FAD 50-65% 2. Apo-Protein wird als inaktives in diesen Experimenten betrachtet, weil ein gebundenes FAD-Cofaktor ist notwendig für die Katalyse. Eine weitere mögliche Einschränkung dieser Methode ist, wenn Prozesse in einem Enzym auftreten schneller als 2 ms (Totzeit der Stopped-Flow) werden sie nicht eingehalten werden, aber there sind Strategien, bei denen Preise gesunken, um dieses Problem überwunden werden kann berichtet. Ein Beispiel dafür die Verwendung einer hohen NaCl-Konzentration in der Reaktion eines Ferredoxin-NADP +-Reduktase 11. Die Wäsche von Sauerstoff aus der Strömungskreislauf der Stopped-Flow ist oft eine heikle Schritt in diesem Experiment und erfordert besondere Aufmerksamkeit. Die Glucose-Oxidase-Glucose hier beschriebene System wird erfolgreich in den meisten Labors verwendet, da es eine effektive und kostengünstige Methode ist. Es gibt jedoch einige Nachteile, die die Produktion von H 2 O 2 sind und für einige Anwendungen der Alternativen, da der Protocatechuat Dioxygenase-Protocatechuat sollte als 12 ist. Die Verwendung eines anaeroben Handschuhfach erleichtert, um anaerobe Bedingungen zu gewährleisten, ist jedoch nicht wesentlich. Sauerstoff muss aus dem Strömungskreislauf der Stopped-Flow entfernt werden, wie wir das Enzym in Abwesenheit von Sauerstoff reduziert werden soll oder reagieren mit Sauerstoff in einer Konzentrations, die wir angeben. Obwohl die Stopped-Flow ist im Handschuhfach, gibt es Sauerstoff in der Strömungskreislauf wenn wir aeroben Puffer verwendet in früheren Experimenten. Zusätzlich zu Absorptionsmessungen, können Fluoreszenz-und Circulardichroismus-Assays in die Angewandte Photophysik SX20 Stopped-Flow-Spektralphotometer mit dem entsprechenden Zubehör durchgeführt werden.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forschung von der NSF Auszeichnung MCB-1021384 gefördert.
Materials
| General Laboratory Equipment | Company | Catalogue Number |
| Vacuum pump | Welch | – |
| Büchner flasks | Fisher | 70340-500 |
| Stir bars | Fisher | 14-512-129 |
| Stir plates | Fisher | 11-100-49S |
| Schlenk lines | Kontes Glass | – |
| Argon tank | Airgas | AR UPC300 |
| Nitrogen tank | Airgas | NI200 |
| Nitrogen tank, ultra high purity grade | Airgas | NI UHP200 |
| Oxygen tank | Airgas | OX 40 |
| 5% Hydrogen balance nitrogen tank | Airgas | X02NI95B200H998 |
| SX20 Stopped-flow spectrophotometer | AppliedPhotophysics | – |
| Glove box | Coy | – |
| Water bath | Brinkmann Lauda | – |
| Supplies | ||
| 50 mL BD Falcon tubes | Fisher | 14-432-23 |
| 15 mL BD Falcon conical tubes | Fisher | 05-527-90 |
| 1.5 mL Eppendorf microcentrifuge tubes | Fisher | 05-402-18 |
| 50 and 25 mL glass vials | Fisher | 06-402 |
| Rubber stoppers | Fisher | 06-447H |
| Aluminum seals | Fisher | 06-406-15 |
| Reagents | ||
| Potassium phosphate, monobasic | Fisher | AC2714080025 |
| Potassium phosphate, dibasic | Fisher | P288-500 |
| Sodium acetate | Sigma | S-2889 |
| Glucose oxidase from A. niger | Sigma | G7141-250KU |
| D-Glucose | Fisher | D16-500 |
| β-NADPH | Fisher | ICN10116783 |
| L(+)-Ornithine hydrochloride | Fisher | ICN10116783 |
References
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