ストップトフロー分光光度法を用いたフラビン依存性モノオキシゲナーゼの還元と酸化の半反応を監視する

1。嫌気性バッファーの調製 100mMリン酸カリウム緩衝液1 L、pHが7.5を準備します。攪拌棒を500 mLのブフナーフラスコにバッファー250mLのを注ぐ。 ゴム栓とフラスコを密封し、攪拌プレート上に置きます。シュレンクラインにフラスコの短いチューブを接続します。 ドガ攪拌しながら室温で5時間真空下でのバッファ。この期間中、毎時間脱気し、アルゴンでフラッシング真空の5つの連続した​​ラウンドを実行します。 10秒間のアルゴンとフラスコをフラッシュし、真空マニホールドから外します。グローブボックス内にフラスコを置きます。 激しく攪拌しながら一晩グローブボックス内でフラスコを開いたままにします。 2。ストップトフローシステムから酸素を除去する 0.1 M酢酸ナトリウム、pH5.0の1リットルを準備します。 250mLのブフナーフラスコに、このバッファ125 mLを注ぎ、ステップ1.2から1.4を実行します。 5を秤量アスペルギルスニジェール （181300 U / g）と0.9グラムのグルコース1.5mlのエッペンドルフチューブと50mlのファルコンコニカルチューブを使用して、それぞれからmgのグルコースオキシダーゼ。グローブボックスに両方のコンテナを配置します。 嫌気性0.1 M酢酸ナトリウム、pH5.0（それぞれ18.13 U / mLと100 mMの、最終濃度）の50 mLのグルコースオキシダーゼとグルコースを溶解する。この溶液（ 図1）貯水池シリンジを満たします。 ドライブのバルブは"負荷"の位置にあることを確認し、ドライブのシリンジ（ 図1）を記入してください。 "ドライブ"の位置にFバルブを回します。プロデータコントロールソフトウェアで空をクリックして、ストップシリンジを空にします。手動で対応するドライブのRAMを上げることによって流路を介して駆動シリンジFからバッファを押してください。このステップの合計で10回繰り返します。他の3つのドライブシリンジと同じ手順を実行します。一時間待ちます。 同じバッファcontaiとリザーバーシリンジのソリューションを置き換えるグルコースオキシダーゼとグルコース寧。手順2.4を繰り返します。 手順2.5を繰り返し、解決策は一晩フローシステムに立つことができます。 一晩インキュベートした後、手順2.5を繰り返します。 3。酸素飽和バッファーの調製 100mMのリン酸カリウム緩衝液（pH7.5）を調製し、攪拌棒を50-mLバイアルに50mLを注ぎます。ウィートンのストッパーとウィートンのアルミシールでバイアルをキャップ。 氷の上でバイアルを置きます。溶液中に100％の酸素を含むタンクに接続されて長い針を浸します。ベントとして、バイアルの栓を介して別の短い針を挿入します。 泡攪拌しながら1時間100％の酸素とソリューションを提供します。 最初のバイアルから短い針を除去し、長い針を取り外す前に、10秒待ちます。グローブボックス内で閉じたバイアルを置きます。 4。 NADPH溶液の調製 1.5 mLのエッペンドルフチュー​​ブにNADPH 1mgを秤量し、iを置くグローブボックスにトン。 嫌気性の100mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.5）300μLでNADPHを溶かす。分光光度計（ε340 nmの = 6270 M -1 cm -1を ）とNADPH濃度を決定するためにグローブボックスから、この溶液の30μLを削除します。 5。酵素溶液からの酸素の除去グローブボックス内の冷凍庫で、解凍から酵素ストック溶液400μLを取る。酵素原液（360μM）は、以前に100mM NaClを含む100mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.5）で調製し、液体窒素中で凍結させた。 攪拌棒25 mLバイアル中に酵素溶液を移し、ウィートンのストッパーとウィートンのアルミシールでバイアルをキャップ、グローブボックスから削除します。 氷の上でバイアルを置き、バイアルの栓に針を挿入することによって、シュレンクラインに接続します。 ドガの連続した​​5ラウンドを行うことにより、酵素溶液1時間ごとに20分を脱気し、アルゴンでフラッシング真空。 10秒間アルゴンバイアルをフラッシュし、真空マニホールドから外します。グローブボックス内の氷の上に瓶を置きます。 6。還元的半反応：監視フラビン還元製造業者のプロトコルに従って、単​​一の混合モードでのストップトフロー測定器とPro-Dataの制御ソフトウェアを準備します。 循環水浴（15℃）をオンにします。 20分間それを通して窒素をバブリングすることにより水から酸素を除去します。これは、フロー回路を介して酸素の混入を防ぐことができます。 循環浴にストップトフローの水浴ハウジングを接続することにより、ドライブシリンジの温度と15の観測セル°Cを維持しています。 プロのデータの制御ソフトウェアを選択してフォトダイオードアレイ、外部トリガ（ストップトフローの動作をアクティブにする）、およびLogaritの[コントロールパネル]ウィンドウでHMIC規模。 プロのデータビューアソフトウェアを起動し、データファイルが格納されるディレクトリを定義します。 嫌気性の100mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.5）と貯水池シリンジCとFのソリューションに置き換えます。 "ドライブ"の位置にCとFバルブを回します。プロのデータ制御ソフトウェアの空をクリックして、ストップシリンジを空にします。手動で（RAMのそれぞれの動きの前に空にするをクリックします）、合計で5回、対応するドライブのRAMを上げることによって流路を介して駆動シリンジの両方からのバッファを押してください。 そのグルコースオキシダーゼが流れ回路から完全に削除されていることを確認するためには、合計で6.6の4倍をステップ実行します。 プロのデータ制御ソフトウェアのベースラインをクリックします。 嫌気性の100mMリン酸カリウム緩衝液（15μMの停止流れの中で混合後の最終濃度）の1100μLに酵素原液の100μLを混和します。 貯水池SYRのソリューションを置き換える酵素溶液とFをインゲ。 "ドライブ"の位置にFバルブを回します。プロのデータ制御ソフトウェアの空をクリックして、ストップシリンジを空にします。手動で対応するドライブのRAMを上げることによって流路を介して駆動シリンジFから酵素液をプッシュします。合計で、この三回を実行します。プロのデータの制御ソフトウェアでは、60秒に取得時間を設定します。 両方のドライブシリンジは、ドライブシリンジのピストンと接触しているそれらに対応するソリューションとドライブの雄羊で満たされていることを確認してください。 "ドライブ"の位置に両方のバルブを回して、ドライブを実行するためにプロのデータ制御ソフトウェアの取得]をクリックします 。三重内のデータを取得するために2倍以上、この手順を繰り返します。酵素の酸化型のこの収量スペクトル。 ドライブから得られた452 nmの値を使用して、（ε452 NM = 13700 M -1 cm -1）を混合する前に酵素濃度を決定し、NADPH solutio 4 mLの準備を■1.5倍以上濃縮した。 6.10で説明したようにNADPH溶液と空の補充停止シリンジで3回リザーバーシリンジCの溶液を交換してください。 ステップ6.11を繰り返します。酵素の減少時にこの収量スペクトルを示す。 7。酸化半反応：監視フラビンの酸化ストップトフロー測定器および製造業者のプロトコルに従って、ダブルミキシング·モードのPro-Dataの制御ソフトウェアを準備します。 ステップ6.2から6.5を繰り返します。 嫌気性の100mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.5）を持つ4つのリザーバーシリンジ内の溶液を交換してください。 "ドライブ"の位置にFバルブを回します。プロのデータ制御ソフトウェアの空をクリックして、ストップシリンジを空にします。手動で対応するドライブのRAMを上げることによって流路を介して駆動シリンジFからバッファを押してください。各ドライブシリンジとの合計でこのステップを5回実行します。 TOTには7.3の4倍をステップ実行します。らは、完全に流れ回路からコンテンツを削除します。 プロのデータ制御ソフトウェアのベースラインをクリックします 。 嫌気性の100mMリン酸カリウム緩衝液（15μMの停止流れの中で混合後の最終濃度）の1000μLに酵素原液の200μLを混和します。 酵素溶液をリザーバーシリンジのソリューションに置き換えます。 "ドライブ"の位置にバルブを回します。プロのデータ制御ソフトウェアの空をクリックして、ストップシリンジを空にします。手動で対応するドライブのRAMを上げることによって、ドライブシリンジから流れ回路を介して酵素溶液をプッシュします。このステップを合計3回を実行します。プロのデータの制御ソフトウェアでは、0.5秒の遅延時間と60秒の取得時間を設定します。 すべてのドライブシリンジは、ドライブシリンジのピストンと接触しているそれらに対応するソリューションとドライブの雄羊で満たされていることを確認してください。 "ドライブ"の位置にすべてのバルブを回しとPro-DATの取得をクリックしますドライブを実行する制御ソフトウェア。三重内のデータを取得するためにこのステップを2回以上繰り返します。酵素の酸化型のこの収量スペクトル。 注射器Aの酵素溶液 "ドライブ"の位置と空の補充停止注射器のように7.7で説明されて三回にBバルブを回して、1.5倍より濃縮されたNADPH溶液とリザーバーシリンジBの溶液を交換してください。 酸素バッファを持つ貯水池注射器Cの溶液を交換してください。ストップシリンジに7.7で説明したように三回の "ドライブ"の位置と空にCのバルブを回して補充。プロのデータの制御ソフトウェアでは、それぞれ、15、900秒での遅延と取得時間を設定します。 手順7.8を繰り返します。完全に減少し、酵素の再酸化の間にこの収量スペクトルを示す。 8。データ解析プロのデータコンバータソフトを起動します。 オプションアイコンをクリックするとProDataCSVに保存]を選択します。 開くデータファイルが格納されていたディレクトリにコピーします。 APLプロのデータコンバータのウィンドウにファイルをドラッグします。データは同じディレクトリ内のCSV形式ファイルとして自動的に保存されます。 をMicrosoft Excel（マイクロソフト、レッドモンド、ワシントン州、米国）を使用してCSV形式のファイルを開きます。 700 nmで対応する吸収を差し引くことによってストップトフロー·トレースのベースラインを正規化します。 適切な指数関数に対応する最大時間に対する吸光度のプロットをフィッティングすることにより、カレイダグラフ（Synergyソフトウェア、読書、PA）を用いて補正トレースを分析する。 図2Bに示すように、452 nmの吸光度をストップトフロー装置内酵素およびNADPHを混合した後、フラビンの削減率を決定するために、時間の関数としてプロットした。この場合、データのベストフィットは、還元、resの第1および第2の位相を計算した二重指数関数方程式と0.65と0.23 s -1の速度を用いて得られたpectively。 C4A-hydroperoxyflavin中間体の形成の速度と酸素が ​​減少する酵素を反応させた後、再酸化を決定するために、我々は、それぞれ380および452 nmであり、（ 図3B）で停止したフローのトレースを分析した。単一の指数関数の式を使用して、我々は、それぞれ、酸化半反応の第一および第二のステップで1.4と0.006 s -1の速度を算出した。 9。代表的な結果前のセクションで説明した実験結果からは、fキンゴジカの還元の半反応はフラビンの酸化還元状態の変化に対応する452 nmの吸光度の変化を測定することにより監視することができる方法を示しています。このステップの速度は、適切な式（;ステップ8.4 図2）にデータをフィッティングすることにより決定することができます。得られた削減率（0.65秒-1）と計算されたk個の猫値に似ています還元反応の律速段階であることを示唆している定常状態の実験2。ストップトフローのダブルミキシング·モードを活用して、酸化し、この半反応における中間体の速度が（;ステップ8.4 図3）決定することができます。 Fキンゴジカによって触媒される反応では、C4A-hydroperoxyflavinは明らかに（380nmのλmax）で検出され、形成と崩壊の速度を計算することができます。得られた再酸化（0.006秒-1）の遅い速度は、C4A-hydroperoxyflavinが存在しない場合にオルニチン非常に安定であることを示します。 スキーム1。Fキンゴジカのメカニズム。 FAD補のisoallozaxineリングが表示されます。酸化フラビン（）は、NADPH（B）に結合してフラビンとNADP +（C）を還元型に反応します。酸素分子との結合との反応後オルニチン、C4A-hydroperoxyflavin（D）が形成される。これは、ヒドロキシル化種である。オルニチンの水酸化の後、hydroxyflavin（E）は、酸化酵素を形成するために脱水する必要があります。 NADP +は、触媒サイクルを通して結合したままで、（F）をリリースする最後の製品です。 図1ストップトフロー測定器。 A）応用光物性SX20のコンポーネントの写真ストップトフロー分光光度計を。サンプルハンドリングユニットのB）画像。ダブルミキシング·モードでのフロー回路のC）スキーム。 図2。ストップトフロー測定器でNADPHとキンゴジカの嫌気性減少。 30μMと45μMキンゴジカのNADPHの等量を混合した後に記録された）スペクトルの変化。第一スペクトル（酸化SIDA）と最後のスペクトル（完全に削減シド）は、それぞれ青と赤で強調表示されます。 B）の吸光度は時間の関数として記録された452 nmでトレースします。 ストップトフロー測定器でキンゴジカの図3。酸化。 A）スペクトルの変化は完全に低下しキンゴジカと酸素バッファの等量を混合した後に記録されます。最終濃度は15μMSIDA、22.5μMのNADPH、および0.95 mMの酸素であった。スペクトルは、0.034、4.268で記録され、727.494 sは、それぞれ完全に減少する酵素、C4A-hydroperoxyflavin中間体（380nmのλmax）、および酸化酵素（450nmのλmax）に対応しています。 B）382及び452 nmでの吸光度トレースは時間の関数として記録されます。