Monitorar os redutivas e oxidativo semi-reações de um Monooxigenase Flavin-Dependent usando stopped-flow Espectrofotometria

1. Preparação do Tampão Anaerobic Prepare 1 L de tampão fosfato 100 mM de potássio, pH 7,5. Verter 250 mL de tampão para um balão de 500-mL Büchner com uma barra de agitação. Fechar bem o frasco com uma rolha de borracha e colocá-lo em uma placa de agitação. Ligue o tubo curto do balão a uma linha de Schlenk. Degas tampão a sob vácuo durante 5 horas à temperatura ambiente com agitação. Durante este período de tempo, realizar 5 rodadas consecutivas de desgaseificação a vácuo e lavagem com argônio a cada hora. Lavar o balão com argônio por 10 segundos e desligue-o da tubagem de vácuo. Colocar o balão no interior da caixa de luva. Deixar o balão aberto na caixa de luva durante a noite com agitação vigorosa. 2. Remoção do oxigênio do sistema parou de fluxo Prepare 1 L de acetato de sódio 0,1 M, pH 5,0. Verter 125 mL deste tampão para um balão de 250-mL Büchner e executar os passos 1,2-1,4. Pesar 5mg oxidase de glicose a partir de Aspergillus niger (181,300 U / g) e 0,9 g de glicose utilizando um tubo Eppendorf de 1,5 mL e 50 mL Falcon tubo cónico, respectivamente. Coloque os dois recipientes no porta-luvas. Dissolve-se a glicose oxidase e glucose em 50 mL de acetato de anaeróbio de sódio 0,1 M, pH 5,0 (concentrações finais de 18,13 U / mL e 100 mm, respectivamente). Encha as seringas reservatório com esta solução (Figura 1). Certifique-se que as válvulas do motor estão no a "carga" de posição e preencher as seringas unidade (Figura 1). Gire a válvula de F para o "drive" de posição. Esvazie a seringa parar clicando no Vazio no software de controle Pro-Data. Empurre o tampão de F seringa unidade através do circuito de fluxo manualmente, aumentando a memória RAM da unidade correspondente. Repetir este passo dez vezes no total. Execute o mesmo procedimento com os outros três seringas de unidade. Espere uma hora. Substituir a solução das seringas reservatório com o mesmo tampão containing glicose oxidase e glucose. Repita o passo 2.4. Repetir o passo 2,5 e permitir que a solução em repouso no sistema de fluxo durante a noite. Após a incubação durante a noite, repita o passo 2.5. 3. Preparação do Tampão de oxigênio saturado Preparar 100 mM de tampão fosfato de potássio (pH 7,5) e deitar 50 mL para um frasco de 50 ml com uma barra de agitação. Tapar o frasco com uma rolha de Wheaton e um selo de alumínio Wheaton. Colocar o frasco em gelo. Mergulhar uma agulha longa ligado a um tanque contendo 100% de oxigénio na solução. Insira outra agulha curta através da tampa do frasco como um respiradouro. Solução a bolha de oxigénio a 100% durante 1 hora com agitação. Primeiro, remova a agulha curta do frasco e aguarde 10 segundos antes de remover a agulha longa. Colocar o frasco fechado na caixa de luva. 4. Preparação da solução de NADPH Pesar 1 mg de NADPH num tubo Eppendorf de 1,5 mL e colocar it para o porta-luvas. Dissolve-se o NADPH em 300 uL de anaeróbio 100 mM de tampão fosfato de potássio, pH 7,5. Remover 30 uL desta solução a partir da caixa de luva para determinar a concentração de NADPH com um espectrofotómetro (ε 340 nm = 6.270 M -1 cm -1). 5. Remoção de oxigénio da solução de enzima Tome 400 uL de solução de estoque de enzima a partir do congelador e descongelamento na caixa de luva. A solução-mãe da enzima (360 uM) foi previamente preparado em tampão fosfato 100 mM de potássio (pH 7,5) contendo 100 mM de NaCl, e congelados em azoto líquido. Transferir a solução de enzima para um frasco de 25 mL com uma barra de agitação, limitar o frasco com uma rolha de Wheaton e um selo de alumínio Wheaton e remover a partir da caixa de luva. Coloque o frasco no gelo e conectá-lo a uma linha Schlenk inserindo uma agulha através da tampa do frasco. Desgaseificar a solução de enzima através da realização de 5 rodadas consecutivos dede desgaseificação a vácuo e lavagem com árgon a cada 20 minutos durante 1 hora. Lave o frasco com argônio por 10 segundos e desligue-o da tubagem de vácuo. Coloque o frasco em gelo no interior do porta-luvas. 6. Redutora semi-reação: Redução Flavin Monitoramento Preparar o instrumento stopped-flow e do software de controlo Pro-Dados para o modo de mistura único seguindo o protocolo do fabricante. Ligue um banho de água circulante (15 ° C). Remover o oxigénio a partir da água por borbulhamento de azoto através dele durante 20 minutos. Isto impede a contaminação de oxigénio através do circuito de fluxo. Manter a temperatura das seringas de unidade ea célula de observação a 15 ° C através da ligação do invólucro banho de água do stopped-flow para o banho de circulação. Na janela Painel de controle do controle de matriz software Pro-Data Photodiode select, trigger externo (para ativar a parada do fluxo de operação), e Logaritescala hmic. Inicie o software de visualização Pro-Data e definir o diretório onde os arquivos de dados serão armazenados. Substituir a solução de reservatório seringas C e F com anaeróbio tampão fosfato 100 mM de potássio (pH 7,5). Gire o C e F válvulas para o "drive" de posição. Esvazie a seringa parada clicando Vazio no software de controle Pro-Data. Empurre o tampão de ambas as seringas a unidade através do circuito de fluxo manualmente, aumentando a unidade correspondente ram cinco vezes no total (clique em Esvaziar antes de cada movimento do carneiro). A fim de assegurar que a glucose oxidase foi completamente removido a partir do circuito de fluxo, realizar o passo 6.6 quatro vezes no total. Clique na linha de base no software de controle Pro-Data. Misturar 100 uL de solução de estoque de enzima com 1100 uL de anaeróbio 100 mM de tampão fosfato de potássio (concentração final após a mistura no fluxo parado de 15 uM). Substituir a solução de reservatório syrF Inge com a solução de enzima. Gire a válvula de F para o "drive" de posição. Esvazie a seringa parada clicando Vazio no software de controle Pro-Data. Empurre a solução de enzima a partir de F seringa unidade através do circuito de fluxo manualmente, aumentando a memória RAM da unidade correspondente. Realizar esta três vezes no total. No software de controle Pro-Data, definir o tempo de aquisição de 60 s. Certifique-se que ambas as seringas unidade são preenchidos com as soluções correspondentes e carneiros da unidade estão em contato com os pistões de seringa de unidade. Vire ambas as válvulas para o "drive" e clique em Adquirir posição no software de controle Pro-dados para realizar a unidade. Repetir este passo mais duas vezes para obter os dados em triplicado. Este espectros rendimentos da forma oxidada da enzima. Usando o Um valor nm 452 obtido a partir das unidades, determinar a concentração de enzima antes da mistura (ε 452 nm = 13.700 M -1 cm -1) e preparar 4 mL de uma soluçã NADPHn de 1,5 vezes mais concentrado. Substituir a solução de reservatório seringa C com a solução de NADPH e vazias e de recarga da seringa paragem três vezes tal como descrito em 6,10. Repita o passo 6.11. Este espectros rendimentos durante a redução da enzima. 7. Oxidativo semi-reação: Oxidação Flavin Monitoramento Preparar o instrumento stopped-flow e do software de controlo Pro-Dados para o modo de mistura duas vezes seguindo o protocolo do fabricante. Repita os passos 6.2-6.5. Substituir a solução nas quatro seringas reservatório com anaeróbio tampão fosfato 100 mM de potássio (pH 7,5). Gire a válvula de F para o "drive" de posição. Esvazie a seringa parada clicando Vazio no software de controle Pro-Data. Empurre o tampão da seringa F unidade através do circuito de fluxo manualmente, aumentando a memória RAM da unidade correspondente. Executar este passo cinco vezes, no total, com cada unidade de seringa. Execute o passo 7.3 quatro vezes em total de remover completamente o conteúdo a partir do circuito de fluxo. Clique de linha de base no software de controlo Pro-Dados. Misturar 200 uL de solução de estoque de enzima com 1000 uL de anaeróbio 100 mM de tampão fosfato de potássio (concentração final após a mistura no fluxo parado de 15 uM). Substituir a solução de seringa reservatório A com a solução de enzima. Gire a válvula A para o "drive" de posição. Esvazie a seringa parada clicando Vazio no software de controle Pro-Data. Empurrar a solução de enzima a partir de seringa unidade A através do circuito de fluxo por manualmente elevar o carneiro unidade correspondente. Executar este passo três vezes no total. No software de controle Pro-Data, definir o tempo de atraso de 0,5 s e tempo de aquisição de 60 s. Garantir que todas as seringas unidade são preenchidos com as soluções correspondentes e carneiros unidade estão em contato com os pistões de seringa de unidade. Ligue todas as válvulas para o "drive" e clique em Adquirir posição na Pro-Datum software de controlo para executar a unidade. Repetir este passo mais duas vezes para obter os dados em triplicado. Este espectros rendimentos da forma oxidada da enzima. Substituir a solução de seringa reservatório B com uma solução de NADPH 1,5 vezes mais concentrada do que a solução de enzima em seringa A. Rode a válvula B para o "unidade" posição e vazio e reenchimento da seringa paragem três vezes, conforme descrito em 7.7. Substituir a solução de reservatório seringa C com tampão oxigenado. Gire a válvula C para o "drive" posição vazia e encher a seringa parar três vezes como descrito em 7.7. No software de controle Pro-Data, definir o tempo de atraso e aquisição de 15 e 900 s, respectivamente. Repita o passo 7.8. Este espectros rendimentos durante a reoxidação da enzima completamente reduzida. 8. Análise de Dados Inicie o software do conversor Pro-Data. Clique no ícone Opções e selecione Salvar em ProDataCSV. Abertoo diretório onde os arquivos de dados foram armazenados. Arraste os arquivos para a janela do conversor Pro-APL de dados. Os dados serão salvos automaticamente como arquivos no formato CSV no mesmo diretório. Abra os arquivos no formato CSV usando o Microsoft Excel (Microsoft, Redmond, WA, EUA). Normalizar a linha de base dos traços de stopped-flow subtraindo a absorção correspondente a 700 nm. Analisar os vestígios corrigida utilizando KaleidaGraph (Synergy Software, Reading, PA) por meio de ajuste da trama da absorvância no máximo correspondente versus tempo para a função apropriada exponencial. Como mostrado na Figura 2B, a absorvância a 452 nm foi representada graficamente como uma função do tempo, a fim de determinar a taxa de redução de flavina após a mistura da enzima e NADPH no instrumento de stopped-flow. Neste caso, o melhor ajuste dos dados foi obtida usando uma equação exponencial dupla e as taxas de 0,65 e 0,23 s -1 foram calculados para a primeira fase ea segunda parte da redução, respectivamente. Para determinar a taxa de formação do intermediário C4a-hydroperoxyflavin ea reoxidação depois reagir o enzima reduzida com oxigénio, foram analisados ​​os vestígios de stopped-flow a 380 e 452 nm, respectivamente (Figura 3B). Usando uma equação exponencial simples, calculou-se as taxas de 1,4 e 0,006 s -1 para o primeiro passo e do segundo oxidativo semi-reacção, respectivamente. 9. Os resultados representativos Os resultados das experiências descritas nas secções anteriores mostram como o redutiva semi-reacção de A Sida f pode ser monitorizada medindo as mudanças na absorvância a 452 nm, que correspondem às alterações no estado redox da flavina. A taxa de este passo pode ser determinado pelo ajuste dos dados à equação apropriado (Figura 2; Passo 8,4). A taxa de redução obtida (0,65 s -1) é semelhante ao valor calculado com kcatde estado estacionário experiências 2, sugerindo que a redução é o passo determinante da taxa da reacção. Tirando vantagem do modo de dupla mistura do stopped-flow, a taxa de oxidação e os intermediários neste semi-reacção pode ser determinada (Figura 3; Passo 8,4). Na reacção catalisada por um Sida f, o C4a-hydroperoxyflavin é claramente detectado (λ max de 380 nm), e da taxa de formação e de decaimento pode ser calculada. A taxa lenta do reoxidação obtido (0,006 s -1) indica que o C4a-hydroperoxyflavin é muito estável na ausência do ornitina. Mecanismo Esquema 1. De A Sida f. O anel isoallozaxine do cofactor FAD é mostrado. A flavina oxidada (A) se liga a NADPH (B) e reage para formar flavina reduzida e NADP + (C). Após reação com o oxigênio molecular e ligação deornitina, o C4a-hydroperoxyflavin é formado (D). Esta é a espécie de hidroxilação. Depois de hidroxilação de ornitina, o hydroxyflavin (E) deve ser desidratado para formar a enzima oxidado. NADP + mantém ligado durante todo o ciclo catalítico e é o último produto a ser libertada (F). Figura 1. O instrumento de stopped-flow. A) Imagem de os componentes do Fotofísica Aplicada SX20 parou-fluxo espectrofotómetro. B) Imagem da unidade de manipulação da amostra. C) Esquema do circuito de fluxo no modo de mistura de casal. Figura 2. Redução anaeróbia de Sida com NADPH no instrumento de stopped-flow. A muda) espectrais registrados após a mistura de volumes iguais de 30 mm Sida e 45 mM NADPH. O primeiro espectro (oxidado Sida) e espectro última (totalmente reduzida SidA) é destacada em azul e vermelho, respectivamente. B) de rastreio de absorvância a 452 nm registadas como uma função do tempo. Figura 3. Oxidação de Sida no instrumento de stopped-flow. A) mudanças espectrais registada após a mistura de volumes iguais de a Sida totalmente reduzido e tampão oxigenado. As concentrações finais foram de 15 mM Sida, 22,5 mM NADPH, oxigênio e 0,95 mM. O espectro registado no 0,034, 4,268, e 727,494 s corresponde à enzima completamente reduzido, o intermediário C4a-hydroperoxyflavin (λ max de 380 nm), ea enzima oxidado (λ max de 450 nm), respectivamente. B) de rastreio de absorvância a 382 nm e 452 registadas como uma função do tempo.