Durduruldu-Akış Spektrofotometri kullanarak Flavin-Bağımlı monooksijenaz ve indirgeyici ve Oksidatif Yarı-Tepkime İzlenmesi

1. Anaerobik Tampon Hazırlanması 100 mM potasyum fosfat tamponu, pH 7.5 1 L hazırlayın. Bir karıştırıcı çubuğa sahip bir 500 ml'lik şişe içine Büchner tamponun 250 mL dökülür. Bir lastik tıpa ile şişesi Seal ve bir karıştırma plaka üzerine yerleştirin. Bir Schlenk hattına balonun kısa tüp bağlayın. Ajitasyon ile oda sıcaklığında 5 saat boyunca vakum altında Degas tamponu. Bu süre boyunca, her saat gaz giderme ve argon püskürtülerek vakum 5 eliniz gerçekleştirin. 10 saniye için argon ile şişesi yıkayın ve vakum manifoldu ayırın. Torpido gözü içine konur. Kuvvetli çalkalama ile gece torpido gözünde şişesi açık bırakın. 2. Durduruldu-akış Sistemi Oksijen Çıkarma 0.1 M sodyum asetat, pH 5.0 1 L hazırlayın. 250 ml Büchner balona bu tamponu 125 ml dökün ve adımları 1,2-1,4 gerçekleştirin. 5 tarttınAspergillus Nijer (181.300 U / g) ve 0.9 g glukoz, 1.5 ml Eppendorf tüp ve 50 ml Falcon konik tüp kullanarak, sırasıyla gelen mg glukoz oksidaz. Torpido gözü içine hem kapları yerleştirin. Anaerobik 0.1 M sodyum asetat, pH 5.0 (nihai 18,13 U / mL 'lik konsantrasyonu ve 100 mM, sırasıyla) 50 mL glukoz oksidaz ve glikoz eritilir. Bu çözelti (Şekil 1) ile rezervuar şırınga doldurun. Sürücü vanalar "yük" konumunda olduğundan emin olun ve sürücü şırınga (Şekil 1) doldurun. "Sürücü" konumuna F vana çevirin. Pro-Data kontrolü yazılımı Boş tıklayarak durdurma şırınga boşaltın. Elle ilgili sürücü ram yükselterek akım devresi aracılığıyla sürücü şırınga F tampon itin. Bu adımı toplam on kez tekrarlayın. Diğer üç sürücü şırınga ile aynı işlemi uygulayın. Bir saat bekleyin. Aynı tampon contai ile rezervuar şırınga çözeltisi yeriniglukoz oksidaz ve glikoz ning. Adım 2.4 tekrarlayın. Tekrar 2.5 adım ve çözüm gecede akış sistemi içinde bekletin. Gecelik inkübasyondan sonra, tekrar 2.5 adım. 3. Oksijen Doymuş Tampon Hazırlanması 100 mM potasyum fosfat tamponu (pH 7.5) hazırlanması ve bir karıştırma çubuğuna sahip bir 50-ml şişe içinde 50 mL dökülür. Bir Wheaton stoper ve bir Wheaton alüminyum mühür ile flakon kap. Buz üzerinde şişe yerleştirin. Çözeltisine% 100 oksijen içeren bir tanka bağlı uzun bir iğne batırmak. Bir kanat olarak flakonun stoper üzerinden başka bir kısa iğne yerleştirin. Ajitasyon ile 1 saat% 100 oksijen ile Kabarcık çözüm. İlk tüpten kısa iğne kaldırmak ve uzun bir iğne çıkarmadan önce 10 saniye bekleyin. Torpido kapalı şişe yerleştirin. 4. NADPH Çözüm hazırlanması 1.5 ml Eppendorf tüp NADPH 1 mg tartılarak i yerleştirintorpido gözü içine t. Anaerobik 100 mM potasyum fosfat tamponu, pH 7.5, 300 uL NADPH eritilir. Bir spektrofotometre (ε 340 nm = 6,270 M -1 cm -1) ile NADPH konsantrasyonunu belirlemek için torpido gözü bu çözüm 30 uL çıkarın. 5.. Enzim Çözüm gelen oksijen giderimi Torpido gözünde dondurucu ve çözülme enzimini stok solüsyonundan 400 uL atın. Enzim stok solüsyonu (360 uM), daha önce 100 mM NaCl ihtiva eden 100 mM potasyum fosfat tamponu (pH 7.5) hazırlanmış ve sıvı azot içinde donduruldu. Bir karıştırma çubuğu ile 25 ml şişeye enzim çözeltisi aktarın, bir Wheaton stoper ve bir Wheaton alüminyum mühür ile flakon kap ve torpido gözü kaldırmak. Buz üzerinde şişe yerleştirin ve flakon stoper ile bir iğne sokarak bir Schlenk hattına bağlayın. Degas 5 eliniz gerçekleştirerek enzim solüsyonu1 saat boyunca her 20 dakikada bir gaz alma ve argon püskürtülerek temizlenmelidir. 10 saniye için argon ile flakon yıkayın ve vakum manifoldu ayırın. Torpido gözü içindeki buz üzerinde şişe yerleştirin. 6. Redüktif Half-tepki: İzleme Flavin Azaltma Durdu akışı enstrüman ve üreticinin protokolü takip tek karıştırma modu için Pro-Data kontrol yazılımı hazırlayın. Bir dolaşan su banyosunda (15 ° C) açın. 20 dakika için azot gazı ile yoluyla su oksijen çıkarın. Bu akış devresi yoluyla oksijen kirlenmesini önleyen. Dolaşımdaki banyosuna durduruldu-akış su banyosu gövde bağlayarak sürücü şırınga sıcaklıkta ve 15 ° C gözlem hücre korur. Pro-Data kontrol yazılımı seçin Photodiode Array, Dış tetik (durdu akışı işlemini aktif) ve Logarit ve Denetim Masası penceresindehmic ölçek. Pro-Data görüntüleyici yazılımı başlatın ve veri dosyalarını saklanacağı dizini tanımlar. Rezervuar şırınga C ve oksijensiz 100 mM potasyum fosfat tamponu (pH 7.5) ile F çözeltisi yerine geçer. "Sürücü" konumuna C ve F vanaları kapatın. Pro-Data kontrolü yazılımı Boş tıklayarak durdurma şırınga boşaltın. Manuel (ram her hareketinden önce Boş tıklayın) toplam ram beş kez ilgili sürücü yükselterek akım devresi boyunca her iki sürücü şırınga olan tampon itin. Bu glukoz oksidaz akım devresi tamamen kaldırılmıştır sağlamak amacıyla, toplam 6.6 dört kez adım gerçekleştirin. Pro-Data kontrol yazılımı bazal tıklayın. Anaerobik 100 mM potasyum fosfat tamponunda (15 uM durduruldu akışta karıştırıldıktan sonra nihai konsantrasyon) ile 1100 uL enzim stok solüsyonundan 100 ul karıştırılır. Rezervuar syr çözümü değiştirinenzim solüsyonu ile birlikte inge F. "Sürücü" konumuna F vana çevirin. Pro-Data kontrolü yazılımı Boş tıklayarak durdurma şırınga boşaltın. Elle ilgili sürücü ram yükselterek akım devresi aracılığıyla sürücü şırınga F enzim çözeltisi itin. Toplam üç kere uygulayın. Pro-Data kontrol yazılımı, 60 s edinimi süresi ayarlayın. Her iki sürücü şırıngalar sürücü şırınga pistonları ile temasta bulunan bunlara karşılık gelen çözümleri ve sürücü koç ile dolu olduğundan emin olun. "Sürücü" konumuna hem vanaları açın ve sürücü gerçekleştirmek için Pro-Data kontrolü yazılımı Acquire tıklatın. Üç kopya olarak verileri elde etmek için iki kat daha fazla bu adımı yineleyin. Enzim okside formunda bu verimler spektrumları. Sürücüleri elde A 452 nm değeri kullanılarak, (ε 452 nm = 13.700 M -1 cm -1) karıştırmadan önce enzim konsantrasyonunun belirlenmesi ve NADPH eriyik 4 mL hazırlanmasın 1,5 kat daha konsantre. NADPH çözüm ve 6.10 açıklandığı gibi boş ve dolum durdurma şırınga üç kez rezervuar şırınga C çözümü değiştirin. Adım 6.11 tekrarlayın. Enzim indirgeme sırasında bu verimler spektrumları. 7. Oksidatif Half-tepki: İzleme Flavin Oksidasyon Durdu akışı enstrüman ve üreticinin protokolü takip çift karıştırma modu için Pro-Data kontrol yazılımı hazırlayın. 6,2-6,5 adımları tekrarlayın. Anaerobik 100 mM potasyum fosfat tamponu (pH 7.5) ile birlikte dört rezervuar şırınga içinde çözelti yerine geçer. "Sürücü" konumuna F vana çevirin. Pro-Data kontrolü yazılımı Boş tıklayarak durdurma şırınga boşaltın. Elle ilgili sürücü ram yükselterek akım devresi aracılığıyla sürücü şırınga F tampon itin. Her sürücü şırınga ile toplam beş kez bu adımı gerçekleştirin. Tot 7.3 dört kez adım gerçekleştirinarkadaşları, tamamen akış devresinden içeriğini çıkarmak için kullanılır. Pro-Data kontrol yazılımı bazal tıklayın. Anaerobik 100 mM potasyum fosfat tamponunda (15 uM durduruldu akışta karıştırıldıktan sonra nihai konsantrasyon) ile 1000 uL enzim stok solüsyonundan 200 ul karıştırılır. Bir enzim solüsyonu ile birlikte rezervuar şırınganın çözeltisi yerine geçer. "Sürücü" konumuna bir kapak kapatın. Pro-Data kontrolü yazılımı Boş tıklayarak durdurma şırınga boşaltın. Elle ilgili sürücü ram yükselterek sürücü şırıngadan bir akım devresi aracılığıyla enzim çözeltisi itin. Bu adımı toplam üç kez uygulayın. Pro-Data kontrol yazılımı olarak, 0,5 s gecikme süresi ve 60 s edinimi süresi ayarlayın. Tüm sürücü şırıngalar sürücü şırınga pistonları ile temasta bulunan bunlara karşılık gelen çözümleri ve sürücü koç ile dolu olduğundan emin olun. "Sürücü" konumuna tüm vanaları açın ve Pro-Dat in Acquire tıklayınsürücü gerçekleştirmek için bir kontrol yazılımı. Üç kopya olarak verileri elde etmek için bu adımı iki kez daha tekrarlayın. Enzim okside formunda bu verimler spektrumları. Şırınga A'da enzim solüsyonu "sürücü" pozisyonu ve boş ve dolum durdurma şırınga 7,7 açıklanan üç kez B vana açma 'den 1.5 kat daha konsantre bir NADPH çözümü ile rezervuar şırınga B çözümü değiştirin. Oksijenli tamponu ile rezervuar şırınga C çözümü değiştirin. "Sürücü" pozisyonu ve boş ve dolum durdurma şırınga 7.7 açıklandığı gibi üç defa C vana çevirin. Pro-Data kontrol yazılımı olarak, sırasıyla 15 ve 900 s gecikme ve satın alma zamanını ayarlayın. Adım 7.8 tekrarlayın. Tamamen indirgenmiş enzim reoxidation sırasında bu verimler spektrumları. 8. Veri Analizi Pro-Data Converter yazılımı başlatın. Seçenekler simgesini tıklayın ve ProDataCSV Kaydet seçeneğini seçin. Açıkveri dosyalarını dizinini muhafaza edildi. APL Pro-Data dönüştürücü penceresine dosyaları sürükleyin. Veriler aynı dizinde CSV formatında dosyalar otomatik olarak kaydedilecektir. Microsoft Excel (Microsoft, Redmond, WA, ABD) ile CSV formatında dosyaları açın. 700 nm'de absorpsiyon karşılık gelen çıkarılarak durduruldu-akış izlerinin taban normalize. Uygun üstel fonksiyonu için zamana karşı gelen maksimum absorbans arsa takarak KaleidaGraph (Sinerji Yazılım, Reading, PA) kullanılarak düzeltilebilir izlerini analiz edin. Şekil 2B, durdurulmuş-akış cihazı içinde enzim ve NADPH karıştırıldıktan sonra flavin redüksiyon oranını belirlemek üzere, zamanın bir fonksiyonu olarak çizilmiştir 452 nm'de absorbans gösterilmiştir. Bu durumda, veri en uygun redüksiyon, res birinci ve ikinci faz için hesaplanmış bir çift üstel denklemi ve 0.65 ve 0.23 s -1 oranları kullanılarak elde edilmiştirolarak bulundu. C4a-hydroperoxyflavin ara ve oksijen ile indirgenmiş enzim reaksiyonu sonrasında reoxidation oluşum oranını belirlemek için, sırasıyla, 380 ve 452 nm, (Şekil 3B) olarak durdurulur-akış izleri analiz edilmiştir. Tek bir üstel denklemi kullanılarak, sırasıyla, yarı-reaksiyonu oksidatif birinci ve ikinci adımı için 1.4 ve 0,006 s -1 oranları hesaplandı. 9. Temsilcisi Sonuçlar Önceki bölümlerde açıklandığı deneyler sonucu bir f Sida indirgeyici yarı-tepkimesi flavin indirgenmiş durumunu değişikliklere karşılık 452 nm de absorbans değişiklikler ölçülerek kontrol edilebilir göstermek. Bu adımın oranı uygun denklemi (; Adım 8,4 Şekil 2) 'ye uyan verileri tarafından tespit edilebilir. Elde edilen giderme oranı (0.65 s-1) ile hesaplanan k kedi değeri benzerindirgeme reaksiyonu hızını-belirleyici adım olduğunu düşündürmektedir kararlı durum deneyler 2,. Durduruldu-akış çift karıştırma modu yararlanarak, oksidasyon ve bu yarı-reaksiyonda aramaddelerinin oranı (; Adım 8,4 Şekil 3) tespit edilebilir. A f Sida tarafından katalizlenen reaksiyon olarak, C4a-hydroperoxyflavin açıkça (380 nm λ max) algılanır ve oluşumu ve çürüme oranı hesaplanabilir. Elde edilen reoxidation (0,006 s -1) ile yavaş oranı C4a-hydroperoxyflavin yokluğunda ornitin çok kararlı olduğunu göstermektedir. A f Sida şeması 1. Mekanizması. FAD kofaktör arasında isoallozaxine halkası gösterilmiştir. Okside flavin (A), NADPH (B) bağlanır ve azaltılmış flavin ve NADP + (C) oluşturmak üzere reaksiyona girer. Moleküler oksijen ve bağlayıcı ile reaksiyondan sonraornitin, C4a-hydroperoxyflavin (D) oluşur. Bu hydroxylating türdür. Ornitin hidroksillenmesi sonra, hydroxyflavin (E) okside enzim oluşturmak üzere susuz olmalıdır. NADP + katalitik döngüsü boyunca bağlı kalır ve (F) çıkacak son üründür. Şekil 1. Durdu akış alet. A) Applied Photophysics SX20 bileşenlerinin Resim durduruldu-akış spektrofotometre. B numune işleme birimi) Resim. Çift karıştırma modunda akım devresi C) Programı. Şekil 2. Durdu akış enstrüman NADPH ile Sida anaerobik azaltılması. 30 uM Sida ve 45 mM NADPH eşit hacimlerde karıştırıldıktan sonra kaydedilen A) Spektral değişir. İlk tayfı (SIDA okside) ve son tayfı (tam Sid azaltılmışA) mavi ve kırmızı sırasıyla vurgulanır. Zamanın bir fonksiyonu olarak kaydedildi 452 nm'de B) absorbans iz. Durdu akış enstrüman Sida Şekil 3. Oksidasyonu. A) tamamen indirgenmiş Sida ve oksijenli tampon karıştırma eşit hacimlerde sonra Spectral değişiklikleri kaydedildi. Nihai konsantrasyon 15 uM Sida, 22.5 mM NADPH, ve 0.95 mM oksijen edildi. Tayfı 0,034, 4,268 kaydedildi ve 727,494 s, sırasıyla, tamamen indirgenmiş enzim, C4a-hydroperoxyflavin ara madde (380 nm λ max), ve oksitlenmiş enzim (450 nm λ max) karşılık gelir. B) 382 ve 452 nm'de absorbans iz zamanın bir fonksiyonu olarak kaydedildi.