LRRK2 Kinaz Aktivitesi Assaying In vitro</em
Summary
Lösin Zengin Kinaz 2 tekrarlayın büyük bir multidomain kinaz, mutasyonlar olan Parkinson hastalığı, en sık rastlanan genetik nedenidir. Bu protein kinaz aktivitesinin analizi, biyoloji ve bu protein disfonksiyonu anlamada çok önemli bir araç olduğu kanıtlanmıştır. Bu çalışmada,<em> In vitro</em> Kinaz aktivitesinin LRRK2 assaying ve varsayılan yüzeyleri ve hastalığı LRRK2 potansiyel disfonksiyon fosforilasyon incelemek için deneysel bir sistem sağlayarak, mutant bir seçim açıklanmıştır.
Abstract
Lösin Zengin Tekrar Kinaz 2 (LRRK2) GTPaz etki alanı (Kompleks proteinlerin Ras, ROC olarak adlandırılır) ve bir kinaz 1 de dahil olmak üzere karmaşık, çoklu yapısını sahip proteinlerin ROCO ailesinin 2527 amino asit üyesidir. Parkinson hastalığı (PH) neden LRRK2 mutasyonlar 2004 yılında keşif normal işlevi, büyük bir araştırma hacmi odağı olmak LRRK2 sonuçlandı ve protein 2,3 hastalık durumu nasıl ters gider . LRRK2 fonksiyonu içine İlk incelemeler, enzimatik faaliyetleri 4-6 odaklandı. Mutasyonlar nedeniyle bu tutarlı bir değişiklik ortaya henüz net bir görüntü olmasına rağmen, gruplar bir dizi veri mutasyonlar 7,8 bağlantılı hücre ölümü LRRK2 kinaz aktivitesini önemini ön plana çıkarmıştır. Yeni yayınlar, anahtar bir deney aracı 9-11 LRRK2 kinaz aktivitesini hedef inhibitörleri bildirdin. Bu verilerin ışığında,LRRK2 enzimatik özellikleri Parkinson için potansiyel ilaç hedefleri olup olmadığı tartışmaya açık olmasına rağmen, bize bu proteinin biyoloji içine önemli bir pencere göze olduğu muhtemeldir.
Farklı yaklaşımların bir dizi tahlil LRRK2, kinaz aktivitesi için kullanılır olmuştur. Başlangıçta, yazı, memeli hücre hatları aşırı epitopu etiketli protein kullanılarak yapıldı ve deneyleri agaroz boncuk 4,5,7 immobilize bu proteini kullanarak yürütülen immunoprecipitated . Daha sonra, çözelti içinde LRRK2 rekombinant parçaları arıtılmış de örneğin LRRK2 12, 2527 artıkları 970 içeren böcek hücrelerinin arınmış bir GST etiketli parçası kullanılır olmuştur. Son zamanlarda, Daniels ve ark., Insan embriyonik böbrek hücreleri, çözüm, tam uzunlukta LRRK2 izolasyonu bildirdi, ancak bu proteinin 13 yaygın olarak kullanılabilir değil. Buna karşılık, GST füzyon LRRK2, şeklinde ticari availabl olduğunu kesilmişe (Invitrogen, ayrıntılı bilgi için bakınız tablo 1) ve LRRK2 kinaz aktivitesi gösteren bir tahlil için uygun bir araç sağlar. LRRK2 kinaz aktivitesi için birçok farklı çıkışları bildirilmiştir. Moesin içinde 558 treonin fosforilasyonu dayalı olarak adlandırılan LRRKtide – LRRK2 kendisi, yapay bir substrat genel bir kinaz substratı ve fosforilasyon gibi Miyelin Temel Protein (MBP) fosforilasyon otofosforilasyon kullanılmış olan, olası fizyolojik yüzeylerin bir dizi var α-sinüklein, Moesin ve 4-EBP 14-17. LRRK2 için substrat olarak bu proteinlerin durumu belirsizliğini koruyor ve aşağıda açıklandığı gibi protokol MBP kullanarak tahlil LRRK2 kinaz aktivitesini potansiyel yüzeylerin bir dizi yöneltilen bu sistemin yararı belirterek, genel bir substrat olarak durulacak.
Protocol
Discussion
Bu kağıt, in vitro sistemi kullanarak LRRK2 kinaz aktivitesini assaying için temel bir protokol tanımlamaktadır . Kısalık çıkarlarını, bu genel bir substrat kullanarak bir saatlik bir bitiş noktası şablonu sınırlı, ama genel bir protokol potansiyel yüzeylerin bir dizi için geçerli ve LRRK2, kinaz aktivitesi kinetik inceleyerek daha sofistike analizler için uygun olan . Bu in vitro sistemde bu gibi bir protein kinaz davranışlarını incelemek için bir kullanmanın en önemli avantajlarından biri vurgulamaktadır: enzim ve substrat konsantrasyonları üzerinde tam bir kontrol olmadığı için, bu kinetik verileri oluşturmak ve K m hesaplamak mümkün reaksiyon ve V max değerleri. Daha detaylı kinetik değerlendirmeler ya da varsayılan inhibitörlerinin etkisinin değerlendirilmesi için, daha yüksek bir verim sistemi (Invitrogen edinilebilir LRRKtide substrat kullanarak sağladığı gibi) üstün bir alternatiburada açıklanan yaklaşım ve
Önemlidir, ancak, in vitro kinaz deneylerindeki tarafından sağlanan indirgemeci model sistem olduğunu kabul ama bir kinaz ve potansiyel substratları ile ilişkileri biyoloji incelemek için tek bir araç . Bu gibi testlerin verileri bir kinaz in vitro ve hücresel bir bağlamda nasıl davrandığını kapsamlı bir resmini elde etmek için diğer yaklaşımlar ile birlikte kullanılmalıdır. Örneğin, in vitro fosforile olası substrat sonra fonksiyonel incelemek için hedeflenen mutagenez (örneğin dönüştürme serin veya treonin fosfat alıcı gibi alanin hiçbiri phosphorylatable kalıntılarının artıkları) tarafından manipüle edilebilir phosphosites tanımlamak için kütle spektrometresi ile analiz edilmesi fosforilasyon ex vivo sonuçları.
Burada önemli olan nokta bu gibi bir in vitro test sisteminde verileri yorumlarken eithe olasılığır Tip I veya Tip II (yanlış pozitif veya yanlış negatif) hataları. Bu sistemin indirgemeci doğa, hem de ne yazık ki bulunmaktadır – eski durumda, saflaştırılmış bir olası substrat (hücresel ortamına göre) ve yapay yakın ve yüksek konsantrasyonda kinaz saflaştırılmış artefactual fosforilasyon olayları neden olabilir. Tersine, birçok kinazlar hücre kapsamında bir kompleksin bir parçası olarak işlev görür ve ortaya belirli bir substrat fosforilasyon için ko-faktörler gerektirir. Yukarıda da belirtildiği gibi, varsayılan bir substrat fosforilasyon olumlu bir sonuç in vitro test sisteminde kullanma sonucu doğrulamak için bir hücresel sistemin test edilmesi gerektiğini ve olumsuz bir sonuç dikkatli yorumlanması gerekir .
Bunun ışığında, ilgi kinaz aktivitesini karşılaştırmalı bir çalışma izin vermek için hem pozitif ve negatif kontrolleri mümkün nerede kritik. Olumlu bir contro dikkatli seçimil, olası substrat phosphorylate olası bir negatif kontrol ile birlikte, faiz protein doğru bilinen bir aktiviteye sahip, son derece değerli. LRRK2 Bir aday kontrolü LRRK2 kinaz etki alanına yakından ilgili birincil dizisi var ama çok farklı bir genel etki alanı yapısı, 18 kinaz 3, etkileşim Reseptör. Bu Invitrogen rekombinant protein olarak mevcuttur ve bizim laboratuvarda standart bir kontrol olarak kullanılır.
LRRK2 piyasada bulunan formu proteinin N-ucu yoksundur ve Glutatyon-s-transferaz ve bu protein kinaz deneyleri yaparken bu potansiyel bir karıştırıcı faktör olarak dikkate alınmalıdır tagged olduğunu da belirtmek gerekir Bilindiği gibi LRRK2 N-terminal, bu proteinin normal işlevini nasıl bir rol oynayabilir. Örneğin, protein yoktur LRRK2 N-terminal kısmı bu protokol,sonra bu gözlenen fosforilasyon üzerinde önemli bir etkisi olacak LRRK2 kinaz etki alanı için belirli bir substrat alımı için kritik in vitro sistemde substrat yukarıda açıklanan söyledi .
Ancak, bu uyarılar bile, Parkinson araştırma LRRK2 biyolojisi önem in vitro ortamda bu proteinin davranışı araştırmak için değerli bir araç olarak bu protokolü yararını vurgulamaktadır.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazar, Parkinson UK Araştırma Görevlisi (hibe F1002). Bu çalışma üyeleri Nöroloji UCL Enstitüsü, Sheffield Üniversitesi ve MRC Protein Fosforilasyon Birimi az Birleşik Krallık Parkinson Kullanıcı Hastalık Konsorsiyumu Nörodejenerasyon ödül Wellcome Trust / MRC Ortak Çağrı (WT089698) (UKPDC) tarafından kısmen desteklenen oldu Dundee Üniversitesi.
Materials
| Reagent | Company | Catalogue Number | Comment |
| LRRK2 wild type | Invitrogen | PV4873 | |
| LRRK2 G2019S | Invitrogen | PV4881 | |
| LRRK2 D1994A | Invitrogen | PV6051 | |
| Kinase buffer | Cell Signalling | 9802S | |
| MBP | Sigma | M1891 | |
| 32P g ATP | Perkin Elmer | BLU002X500UC | 500µCi, 30Ci /mMole |
| 4x LDS sample buffer | Invitrogen | NP0007 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| Protein standards | Invitrogen | LC5800 | |
| MOPS running buffer | Invitrogen | NP0001 | |
| Bis-tris acrylamide gel | Invitrogen | NP0321 | 4-12% 1mm 10well |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| Transfer buffer | Invitrogen | NP0006 |
Table 1. Reagents
Distilled and de-ionized water was used for all dilution steps
| Equipment type | Company | Comment |
| Geiger counter | Mini Instruments | |
| SDS PAGE tank | Invitrogen | |
| Transfer tank | Invitrogen | |
| Heat blocks (2) | Eppendorf | |
| Phosphor screen | GE | X-ray film can be substituted |
| Phosphor imager | GE | |
| Exposure cassette | GE | |
| Centrifuge | Eppendorf | |
| Perspex shielding | ||
| 1.5ml tubes | VWR | Screw top with O ring |
Table 2. Equipment
References
- Lewis, P. A. The function of ROCO proteins in health and disease. Biol. Cell. 101, 183-191 (2009).
- Paisan-Ruiz, C. Cloning of the gene containing mutations that cause PARK8-linked Parkinson’s disease. Neuron. 44, 595-600 (2004).
- Zimprich, A. Mutations in LRRK2 cause autosomal-dominant parkinsonism with pleomorphic pathology. Neuron. 44, 601-607 (2004).
- West, A. B. Parkinson’s disease-associated mutations in leucine-rich repeat kinase 2 augment kinase activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102, 16842-16847 (2005).
- Gloeckner, C. J. The Parkinson disease causing LRRK2 mutation I2020T is associated with increased kinase activity. Hum. Mol. Genet. 15, 223-232 (2006).
- Lewis, P. A. The R1441C mutation of LRRK2 disrupts GTP hydrolysis. Biochem. Biophys. Res. Commun. 357, 668-671 (2007).
- Greggio, E. Kinase activity is required for the toxic effects of mutant LRRK2/dardarin. Neurobiol. Dis. 23, 329-341 (2006).
- Smith, W. W. Kinase activity of mutant LRRK2 mediates neuronal toxicity. Nat. Neurosci. 9, 1231-1233 (2006).
- Deng, X. Characterization of a selective inhibitor of the Parkinson’s disease kinase LRRK2. Nat. Chem. Biol. 7, 203-205 (2011).
- Lee, B. D. Inhibitors of leucine-rich repeat kinase-2 protect against models of Parkinson’s disease. Nat. Med. 16, 998-1000 (2010).
- Nichols, R. J. Substrate specificity and inhibitors of LRRK2, a protein kinase mutated in Parkinson’s disease. The Biochemical Journal. 424, 47-60 (2009).
- Anand, V. S. Investigation of leucine-rich repeat kinase 2: enzymological properties and novel assays. FEBS. J. 276, 466-478 (2009).
- Daniels, V. Insight into the mode of action of the LRRK2 Y1699C pathogenic mutant. Journal of Neurochemistry. 116, 304-315 (2011).
- Jaleel, M. LRRK2 phosphorylates moesin at Thr558; characterisation of how Parkinson’s disease mutants affect kinase activity. Biochem. J. , (2007).
- Qing, H., Wong, W., McGeer, E. G., McGeer, P. L. Lrrk2 phosphorylates alpha synuclein at serine 129: Parkinson disease implications. Biochem. Biophys. Res. Commun. 387, 149-152 (2009).
- Imai, Y. Phosphorylation of 4E-BP by LRRK2 affects the maintenance of dopaminergic neurons in Drosophila. Embo. J. 27, 2432-2443 (2008).
- Greggio, E. The Parkinson disease-associated leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) is a dimer that undergoes intramolecular autophosphorylation. J. Biol. Chem. 283, 16906-16914 (2008).
- Manning, G., Whyte, D. B., Martinez, R., Hunter, T., Sudarsanam, S. The protein kinase complement of the human genome. Science. 298, 1912-1934 (2002).
