Doseamento do atividade da quinase de LRRK2 In vitro</em
Summary
Leucina Quinase Repita Rico 2 é uma quinase de vários domínios de grande porte, mutações em que são a causa genética mais comum da doença de Parkinson. Análise da atividade da proteína quinase tem provado ser uma ferramenta crucial na compreensão da biologia e disfunção desta proteína. Neste artigo,<em> In vitro</em> Assaying da atividade da quinase de LRRK2 e uma seleção de seus mutantes é descrito, fornecendo um sistema experimental para analisar a fosforilação de substratos putativa e disfunção potencial de LRRK2 na doença.
Abstract
Leucina Quinase Repita Rico 2 (LRRK2) é um aminoácido 2527 membro da família ROCO de proteínas, possuindo um complexo, a estrutura de vários domínios, incluindo um domínio GTPase (denominado ROC, por Ras Complexo de proteínas) e um domínio quinase 1. A descoberta em 2004 de mutações em LRRK2 que causam a doença de Parkinson (DP) resultou em LRRK2 sendo o foco de um grande volume de pesquisas sobre a sua função normal e como a proteína vai mal no estado de doença 2,3. As investigações iniciais sobre a função do LRRK2 focada em suas atividades enzimáticas 4-6. Embora uma imagem clara ainda a emergir de uma alteração consistente nestes devido a mutações, dados de um número de grupos destacou a importância da atividade da quinase de LRRK2 na morte da célula ligada a mutações 7,8. Publicações recentes relataram inibidores visando a atividade da quinase de LRRK2, fornecendo uma ferramenta fundamental experimental 9-11. À luz destes dados,É provável que as propriedades enzimáticas de LRRK2 nos proporcionar uma importante janela para a biologia desta proteína, embora se eles são alvos potenciais para drogas de Parkinson é aberto a debate.
Um número de diferentes abordagens têm sido usadas para ensaio da atividade da quinase de LRRK2. Inicialmente, os ensaios foram realizados com proteínas tag epítopo overexpressed em linhagens de células de mamíferos e immunoprecipitated, com os ensaios realizados utilizando essa proteína imobilizada em esferas de agarose 4,5,7. Posteriormente, purificada fragmentos recombinantes de LRRK2 em solução também têm sido utilizados, por exemplo, um fragmento de GST tag purificada a partir de células de inseto contendo resíduos 970-2527 LRRK2 de 12. Recentemente, Daniels et al. Relatado o isolamento de LRRK2 comprimento total em solução de células embrionárias do rim, porém esta proteína não é amplamente disponível 13. Em contraste, a fusão GST truncado forma de LRRK2 é comercialmente available (a partir de Invitrogen, ver Tabela 1 para detalhes), e fornece uma ferramenta conveniente para demonstrar um ensaio para LRRK2 atividade da quinase. Várias saídas diferentes para LRRK2 atividade da quinase têm sido relatados. Autofosforilação de LRRK2 em si, a fosforilação da proteína básica da mielina (MBP) como substrato genérico quinase e fosforilação de um substrato artificial – LRRKtide apelidado, com base na fosforilação da treonina 558 em Moesin – foram todos utilizados, assim como uma série de supostas substratos fisiológicos incluindo α-sinucleína, Moesin e 4-EBP 14-17. O status destas proteínas como substratos para LRRK2 ainda não está claro, e como tal o protocolo descrito a seguir incidirá sobre o uso do MBP como substrato genérico, destacando a utilidade deste sistema para ensaio de atividade quinase LRRK2 dirigido contra uma ampla gama de substratos em potencial.
Protocol
Discussion
Este artigo descreve um protocolo básico para ensaio de atividade da quinase de LRRK2 usando um sistema in vitro. No interesse da brevidade, esta tem sido limitada a um modelo de ponto final de uma hora utilizando um substrato genérico, mas o protocolo geral é aplicável a uma gama de substratos potenciais e passíveis de análises mais sofisticadas examinar a cinética da atividade de quinase de LRRK2 . Isso destaca uma das principais vantagens da utilização de um sistema in vitro para analisar o comportamento de uma proteína quinase como esta: porque não há controle total sobre as concentrações da enzima e do substrato, é possível gerar dados cinéticos K m e calcular e V max para a reação. Para informações mais detalhadas avaliações cinética ou avaliar o impacto dos inibidores putativos, um sistema de maior rendimento (como o que é garantida pela utilização do substrato LRRKtide, disponível a partir Invitrogen) é uma alternati superioresve para a abordagem descrita aqui.
É importante, no entanto, reconhecer que o sistema fornecido pelo modelo reducionista em ensaios in vitro quinase é apenas uma ferramenta para examinar a biologia de uma quinase e suas relações com substratos em potencial. Dados de ensaios como este deve ser usado em conjunto com outras abordagens para obter um quadro abrangente de como se comporta uma quinase in vitro e em um contexto celular. Por exemplo, um substrato putativo fosforilado in vitro podem ser analisados por espectrometria de massa para identificar phosphosites possíveis que podem ser manipulados por mutagênese alvo (por exemplo, serina. Converter ou resíduos de fosfato de treonina aceitador a ninguém-fosforilável resíduos, tais como alanina) para examinar o funcional conseqüências do ex vivo fosforilação.
Uma consideração importante na interpretação dos dados a partir de um sistema de análise in vitro, como este é a probabilidade de either tipo I ou II (falso negativo ou falso positivo) erros. A natureza reducionista deste sistema, infelizmente, dispõe que para ambos – no caso do primeiro, tendo um substrato purificado e purificado putativo quinase em proximidade estreita artificialmente e em alta concentração (em comparação com o meio celular) pode resultar em eventos de fosforilação artefactual. Por outro lado, muitas quinases funcionam como parte de um complexo dentro do contexto da célula, e exigem co-fatores para a fosforilação de um determinado substrato para ocorrer. Como observado acima, um resultado positivo de fosforilação de um substrato utilizando um suposto sistema in vitro deve ser testado em um sistema celular para validar o resultado, e um resultado negativo devem ser interpretados com cautela.
Em vista disso, é fundamental sempre que possível ter os controles positivos e negativos para permitir um estudo comparativo da atividade quinase do seu interesse. A seleção cuidadosa de um contro positival que tem uma atividade conhecida para a sua proteína de interesse, juntamente com um controle negativo que é improvável que fosforilar o substrato putativo, é extremamente valioso. Um controle candidato para LRRK2 é Receptor interagindo quinase 3, que tem uma seqüência estreitamente relacionado primário para o domínio quinase de LRRK2, mas tem uma estrutura de domínio geral muito diferente de 18 anos. Este está disponível como proteína recombinante de Invitrogen e é usado como um controle padrão em nosso laboratório.
Também deve ser notado que a forma comercialmente disponível de LRRK2 falta o N-terminal da proteína e é marcado com glutationa-s-transferase e isso deve ser levado em consideração como um fator potencial de confusão na realização de ensaios com essa proteína quinase, como não se sabe qual o papel que o N-terminal de LRRK2 pode jogar na função normal da proteína. Se, por exemplo, a porção N-terminal de LRRK2 que está ausente na proteína utilizada neste protocoloé fundamental para o recrutamento de um substrato específico para o domínio da quinase LRRK2 então isso terá um impacto importante sobre a fosforilação observado de substrato disse no sistema in vitro descrito acima.
Mesmo com essas ressalvas, no entanto, a importância atribuída à biologia do LRRK2 na pesquisa de Parkinson destaca a utilidade deste protocolo como uma ferramenta valiosa para investigar o comportamento dessa proteína em uma configuração em vitro.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O autor é um Reino Unido de Parkinson Research Fellow (concessão F1002). Este trabalho foi financiado em parte pelo convite Wellcome Trust / MRC conjunta no prêmio Neurodegeneração (WT089698) para Consórcio de Parkinson do Reino Unido de Doenças (UKPDC), cujos membros são do Instituto UCL de Neurologia, da Universidade de Sheffield e da MRC Unidade de fosforilação de proteínas em da Universidade de Dundee.
Materials
| Reagent | Company | Catalogue Number | Comment |
| LRRK2 wild type | Invitrogen | PV4873 | |
| LRRK2 G2019S | Invitrogen | PV4881 | |
| LRRK2 D1994A | Invitrogen | PV6051 | |
| Kinase buffer | Cell Signalling | 9802S | |
| MBP | Sigma | M1891 | |
| 32P g ATP | Perkin Elmer | BLU002X500UC | 500µCi, 30Ci /mMole |
| 4x LDS sample buffer | Invitrogen | NP0007 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| Protein standards | Invitrogen | LC5800 | |
| MOPS running buffer | Invitrogen | NP0001 | |
| Bis-tris acrylamide gel | Invitrogen | NP0321 | 4-12% 1mm 10well |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| Transfer buffer | Invitrogen | NP0006 |
Table 1. Reagents
Distilled and de-ionized water was used for all dilution steps
| Equipment type | Company | Comment |
| Geiger counter | Mini Instruments | |
| SDS PAGE tank | Invitrogen | |
| Transfer tank | Invitrogen | |
| Heat blocks (2) | Eppendorf | |
| Phosphor screen | GE | X-ray film can be substituted |
| Phosphor imager | GE | |
| Exposure cassette | GE | |
| Centrifuge | Eppendorf | |
| Perspex shielding | ||
| 1.5ml tubes | VWR | Screw top with O ring |
Table 2. Equipment
References
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