يعاير النشاط كيناز من LRRK2 في المختبر</em
Summary
يسين كيناز كرر ريتش 2 هو كيناز متعددة المجالات الكبيرة ، والطفرات التي هي السبب الأكثر شيوعا الجينية لمرض الشلل الرعاش. وقد أثبت تحليل للنشاط هذا البروتين كيناز ليكون أداة حاسمة في فهم البيولوجيا واختلال وظيفي في هذا البروتين. في هذه الورقة ،<em> في المختبر</em> معايرة النشاط كيناز من LRRK2 وصفها مجموعة من المسوخ والخمسين ، وتوفير نظام تجريبي لدراسة الفسفرة من ركائز المفترضة وضعف إمكانات LRRK2 في المرض.
Abstract
يسين كيناز كرر ريتش 2 (LRRK2) هو 2527 عضو من الأحماض الأمينية للأسرة روكو من البروتينات ، والتي تمتلك بنية معقدة متعددة المجالات ، بما في ذلك المجال GTPase (وهو ما يسمى ROC ، على رأس مجمع للبروتينات) والمجال كيناز 1. أدى هذا الاكتشاف في عام 2004 طفرات في LRRK2 التي تسبب مرض باركنسون (PD) في LRRK2 يجري التركيز على الكم الهائل من البحوث في وظيفتها الطبيعية ، وكيف ينتقل هذا البروتين منحرف في حالة المرض 2،3 وركزت التحقيقات الأولية في وظيفة LRRK2 عن أنشطته الأنزيمية 4-6. على الرغم من أن صورة واضحة لم يخرج من التغيير المستمر في هذه بسبب الطفرات ، وقد أبرزت البيانات من عدد من المجموعات على أهمية النشاط كيناز من LRRK2 في موت الخلية مرتبطة 7،8 الطفرات. وذكرت المنشورات الحديثة مثبطات استهداف النشاط كيناز من LRRK2 ، وتوفير أداة رئيسية التجريبية 9-11. في ضوء هذه المعطيات ، فإنهومن المرجح أن خصائص الأنزيمية من LRRK2 تحمل لنا نافذة هامة في البيولوجيا من هذا البروتين ، على الرغم من ما إذا كانت الأهداف المحتملة للدواء باركنسون هو مفتوح للنقاش.
وقد تم استخدام عدد من الأساليب المختلفة لفحص النشاط كيناز من LRRK2. في البداية ، وأجريت فحوصات خارج باستخدام بروتين حاتمة الموسومة overexpressed في خطوط خلايا الثدييات وimmunoprecipitated ، مع المقايسات نفذت باستخدام هذا البروتين على أداء وظائفها الخرز agarose 4،5،7. لاحقا ، منقى من شظايا المؤتلف LRRK2 في حل وقد تم أيضا استخدام ، على سبيل المثال جزء من ضريبة السلع والخدمات الموسومة تنقية الخلايا التي تحتوي على مخلفات الحشرات 970-2527 من LRRK2 12. في الآونة الأخيرة ، وآخرون دانيلز وأفادت عزلة LRRK2 طول كامل في حل من خلايا الكلى البشرية الجنينية ، بيد أن هذا البروتين لا يتوفر على نطاق واسع 13. في المقابل ، فإن الانصهار اقتطاع ضريبة السلع والخدمات هو شكل من أشكال LRRK2 المتوفره تجارياه (من Invitrogen ، انظر الجدول رقم 1 للحصول على التفاصيل) ، ويوفر أداة مناسبة ليدل على مقايسة للنشاط كيناز LRRK2. تم الإبلاغ عن نواتج مختلفة للنشاط كيناز LRRK2. Autophosphorylation من LRRK2 نفسها ، الفسفرة من البروتين الأساسي المايلين (MBP) باعتبارها الركيزة كيناز العامة والفسفرة من الركيزة الاصطناعية — LRRKtide يطلق ، على أساس من الفسفرة ثريونين 558 في Moesin — وقد استخدمت جميع ، وكذلك سلسلة من ركائز الفسيولوجية المفترضة بما في ذلك α – synuclein ، وMoesin 4 – EBP 14-17. حالة من هذه البروتينات بمثابة ركائز لLRRK2 يزال من غير الواضح ، وعلى هذا النحو المبين أدناه البروتوكول سوف تركز على استخدام MBP باعتبارها الركيزة عامة ، مشيرا الى ان فائدة هذا النظام لفحص النشاط كيناز LRRK2 موجه ضد مجموعة من ركائز المحتملة
Protocol
Discussion
توضح هذه الورقة الأساسية لبروتوكول يعاير النشاط كيناز من LRRK2 باستخدام النظام في المختبر. لمصلحة من الإيجاز ، فقد اقتصر هذا إلى قالب نقطة نهاية مدته ساعة واحدة باستخدام الركيزة عامة ، ولكن البروتوكول عامة تنطبق على مجموعة من ركائز المحتملة وقابلة للتحليلات أكثر تطورا دراسة حركية النشاط كيناز من LRRK2 . هذا يسلط الضوء على واحدة من المزايا الرئيسية لاستخدام النظام في المختبر لدراسة السلوك من بروتين كيناز مثل هذا : لأن هناك سيطرة كاملة على تركيز الانزيم والركيزة ، فمن الممكن لتوليد البيانات الحركية وحساب K م والخامس القيم القصوى للتفاعل. لتقييم حركية أكثر تفصيلا أو تقييم تأثير مثبطات المفترضين ، نظام أعلى إنتاجية (مثل تلك التي يوفرها استخدام الركيزة LRRKtide ، التي تتوفر من Invitrogen) هو alternati متفوقةلقد لنهج وصفها هنا.
ومن المهم ، مع ذلك ، أن نعترف بأن النظام النموذجي الاختزالية التي قدمها في فحوصات المختبر كيناز ما هو إلا أداة واحدة لدراسة علم الأحياء لكيناز وعلاقاتها مع ركائز المحتملة. وينبغي استخدام البيانات من مثل هذه المقايسات بالاقتران مع المناهج الأخرى للحصول على صورة شاملة عن كيفية كيناز في المختبر ، ويتصرف في سياق الخليوي. على سبيل المثال ، يمكن تحليل ركيزة المفترضة فسفرته في المختبر عن طريق قياس الطيف الكتلي لتحديد phosphosites المحتملة التي يمكن أن تكون ثم يتلاعب بها الطفرات المستهدفة (على سبيل المثال. السيرين ثريونين أو تحويل مخلفات الفوسفات متقبل مقابل لا شيء ، مثل بقايا phosphorylatable ألانين) لدراسة وظيفية عواقب فيفو السابقين الفسفرة.
وهناك اعتبار رئيسي في تفسير البيانات من نظام فحص في المختبر مثل هذا احتمال eitheص النوع الأول أو النوع الثاني (إيجابية أو سلبية كاذبة كاذبة) أخطاء. الطبيعة الاختزالية لهذا النظام يتصرف مع الأسف ، فهو على حد سواء — لا يمكن في حالة من السابق ، بعد أن ركيزة المنقى المفترضة وتنقيته كيناز على مقربة بشكل مصطنع وعلى تركيز عال (بالمقارنة مع الوسط الخليوي) نتيجة الأحداث في الفسفرة artefactual. على العكس ، الكثير من تحركات وظيفة كجزء من مجمع في إطار الخلية ، وتتطلب التعاون من عوامل الفسفرة ركيزة تعطى للتحدث. ثم ينبغي على النحو المذكور أعلاه ، وهذه نتيجة إيجابية من الفسفرة من المفترض ركيزة باستخدام نظام مقايسة في المختبر يتم اختبارها في نظام الهاتف الخلوي للتحقق من صحة ذلك ، وينبغي أن تفسر نتيجة سلبية بحذر.
في ضوء ذلك ، فمن الأهمية بمكان حيث من الممكن أن الضوابط الإيجابية والسلبية للسماح للدراسة المقارنة للنشاط كيناز اهتمامك. الاختيار الدقيق لكنترول إيجابيةل الذي يحتوي على البروتين نحو النشاط المعروف اهتمامك ، جنبا إلى جنب مع الرقابة السلبية التي من غير المرجح أن phosphorylate الركيزة الخاص المفترضة ، هي قيمة للغاية. عنصر تحكم واحد مرشح لLRRK2 هو التفاعل مستقبلات كيناز 3 ، والذي لديه صلة وثيقة تسلسل الأولية إلى المجال كيناز من LRRK2 ولكن لديها مختلفة تماما بنية المجال العام 18. هذا هو متاح في المؤتلف من البروتين Invitrogen ويستخدم كعنصر تحكم قياسية في مختبرنا.
وينبغي أيضا أن يلاحظ أن النموذج متاح تجاريا LRRK2 يفتقر إلى N – محطة من البروتين ، والموسومة ب اكسيداز – S – ترانسفيراز وينبغي أن يؤخذ ذلك في الاعتبار كعامل الخلط المحتملة عند تنفيذ المقايسات كيناز مع هذا البروتين ، كما ليس من المعروف ما هو الدور الذي يمكن للمحطة من N – LRRK2 يلعب في وظيفة طبيعية من هذا البروتين. إذا ، على سبيل المثال ، جزء من محطة N – LRRK2 أن تغيب في البروتين المستخدم في هذا البروتوكولهو أمر حاسم لتجنيد ركيزة معينة إلى المجال كيناز من LRRK2 فهذا سيكون له تأثير كبير على الفسفرة وحظ من قال الركيزة في المختبر في النظام الموصوف أعلاه.
حتى مع هذه المحاذير ، ولكن ، على الأهمية التي توليها لبيولوجيا LRRK2 في البحوث باركنسون يسلط الضوء على فائدة هذا البروتوكول بمثابة أداة قيمة للتحقيق في سلوك هذا البروتين في الإعداد في المختبر.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
والمؤلف هو باركنسون زميل أبحاث في المملكة المتحدة (منحة F1002). وأيد هذا العمل في جزء من الدعوة ترست / MRC يلكوم المشتركة في الجائزة تنكس عصبي (WT089698) لكونسورتيوم مرض باركنسون في المملكة المتحدة (UKPDC) أعضاؤها من المعهد دوري أبطال أوروبا لعلم الأعصاب ، وجامعة شيفيلد والفسفرة البروتين MRC الوحدة في جامعة دندي.
Materials
| Reagent | Company | Catalogue Number | Comment |
| LRRK2 wild type | Invitrogen | PV4873 | |
| LRRK2 G2019S | Invitrogen | PV4881 | |
| LRRK2 D1994A | Invitrogen | PV6051 | |
| Kinase buffer | Cell Signalling | 9802S | |
| MBP | Sigma | M1891 | |
| 32P g ATP | Perkin Elmer | BLU002X500UC | 500µCi, 30Ci /mMole |
| 4x LDS sample buffer | Invitrogen | NP0007 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| Protein standards | Invitrogen | LC5800 | |
| MOPS running buffer | Invitrogen | NP0001 | |
| Bis-tris acrylamide gel | Invitrogen | NP0321 | 4-12% 1mm 10well |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| Transfer buffer | Invitrogen | NP0006 |
Table 1. Reagents
Distilled and de-ionized water was used for all dilution steps
| Equipment type | Company | Comment |
| Geiger counter | Mini Instruments | |
| SDS PAGE tank | Invitrogen | |
| Transfer tank | Invitrogen | |
| Heat blocks (2) | Eppendorf | |
| Phosphor screen | GE | X-ray film can be substituted |
| Phosphor imager | GE | |
| Exposure cassette | GE | |
| Centrifuge | Eppendorf | |
| Perspex shielding | ||
| 1.5ml tubes | VWR | Screw top with O ring |
Table 2. Equipment
References
- Lewis, P. A. The function of ROCO proteins in health and disease. Biol. Cell. 101, 183-191 (2009).
- Paisan-Ruiz, C. Cloning of the gene containing mutations that cause PARK8-linked Parkinson’s disease. Neuron. 44, 595-600 (2004).
- Zimprich, A. Mutations in LRRK2 cause autosomal-dominant parkinsonism with pleomorphic pathology. Neuron. 44, 601-607 (2004).
- West, A. B. Parkinson’s disease-associated mutations in leucine-rich repeat kinase 2 augment kinase activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102, 16842-16847 (2005).
- Gloeckner, C. J. The Parkinson disease causing LRRK2 mutation I2020T is associated with increased kinase activity. Hum. Mol. Genet. 15, 223-232 (2006).
- Lewis, P. A. The R1441C mutation of LRRK2 disrupts GTP hydrolysis. Biochem. Biophys. Res. Commun. 357, 668-671 (2007).
- Greggio, E. Kinase activity is required for the toxic effects of mutant LRRK2/dardarin. Neurobiol. Dis. 23, 329-341 (2006).
- Smith, W. W. Kinase activity of mutant LRRK2 mediates neuronal toxicity. Nat. Neurosci. 9, 1231-1233 (2006).
- Deng, X. Characterization of a selective inhibitor of the Parkinson’s disease kinase LRRK2. Nat. Chem. Biol. 7, 203-205 (2011).
- Lee, B. D. Inhibitors of leucine-rich repeat kinase-2 protect against models of Parkinson’s disease. Nat. Med. 16, 998-1000 (2010).
- Nichols, R. J. Substrate specificity and inhibitors of LRRK2, a protein kinase mutated in Parkinson’s disease. The Biochemical Journal. 424, 47-60 (2009).
- Anand, V. S. Investigation of leucine-rich repeat kinase 2: enzymological properties and novel assays. FEBS. J. 276, 466-478 (2009).
- Daniels, V. Insight into the mode of action of the LRRK2 Y1699C pathogenic mutant. Journal of Neurochemistry. 116, 304-315 (2011).
- Jaleel, M. LRRK2 phosphorylates moesin at Thr558; characterisation of how Parkinson’s disease mutants affect kinase activity. Biochem. J. , (2007).
- Qing, H., Wong, W., McGeer, E. G., McGeer, P. L. Lrrk2 phosphorylates alpha synuclein at serine 129: Parkinson disease implications. Biochem. Biophys. Res. Commun. 387, 149-152 (2009).
- Imai, Y. Phosphorylation of 4E-BP by LRRK2 affects the maintenance of dopaminergic neurons in Drosophila. Embo. J. 27, 2432-2443 (2008).
- Greggio, E. The Parkinson disease-associated leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) is a dimer that undergoes intramolecular autophosphorylation. J. Biol. Chem. 283, 16906-16914 (2008).
- Manning, G., Whyte, D. B., Martinez, R., Hunter, T., Sudarsanam, S. The protein kinase complement of the human genome. Science. 298, 1912-1934 (2002).
