Het testen van de kinase-activiteit van LRRK2 In vitro</em
Summary
Leucine Rich Herhaal Kinase 2 is een grote multidomein kinase, mutaties in die de meest voorkomende genetische oorzaak van de ziekte van Parkinson. Analyse van de kinase-activiteit van dit eiwit heeft zich bewezen als een essentieel instrument in het begrijpen van de biologie en de disfunctie van dit eiwit te zijn. In dit artikel,<em> In vitro</em> Het testen van de kinase-activiteit van LRRK2 en een selectie van de mutanten is beschreven, het verstrekken van een experimenteel systeem de fosforylering van vermeende substraten en mogelijke dysfunctie van LRRK2 in de ziekte te onderzoeken.
Abstract
Leucine Rich Herhaal Kinase 2 (LRRK2) is een aminozuur 2527 lid van de ROCO familie van eiwitten, het bezit van een complex, multidomein structuur met inbegrip van een GTPase domein (genoemd ROC, voor Ras van complexe eiwitten) en een kinase domein 1. De ontdekking in 2004 van de mutaties in LRRK2 dat de ziekte van Parkinson (PD) veroorzaken resulteerde in LRRK2 zijnde de focus van een grote hoeveelheid van het onderzoek in zijn normale functie en de manier waarop het eiwit mis gaat in de ziekte staat 2,3. Eerste onderzoek naar de functie van LRRK2 gericht op de enzymatische activiteiten 4-6. Hoewel een duidelijk beeld moet nog komen van een consistente verandering in deze als gevolg van mutaties, heeft de gegevens van een aantal groepen gewezen op het belang van de kinase-activiteit van de LRRK2 in celdood gekoppeld aan mutaties 7,8. Recente publicaties hebben gemeld remmers gericht op de kinase-activiteit van LRRK2, waardoor een belangrijk experimenteel instrument 9-11. In het licht van deze gegevens is hetis het waarschijnlijk dat de enzymatische eigenschappen van LRRK2 veroorloven ons een belangrijk venster naar de biologie van dit eiwit, maar of ze zijn potentiële drug targets voor Parkinson is open voor discussie.
Een aantal verschillende benaderingen zijn gebruikt voor het testen van de kinase-activiteit van LRRK2. Aanvankelijk werden testen uitgevoerd met behulp van epitoop-gemerkte eiwit tot overexpressie gebracht in zoogdiercellen cellijnen en immunogeprecipiteerd, met de testen uitgevoerd met behulp van dit eiwit geïmmobiliseerd op agarose parels 4,5,7. Vervolgens hebben gezuiverde recombinante fragmenten van LRRK2 in oplossing ook gebruikt, bijvoorbeeld een GST gelabeld fragment gezuiverd van insectencellen die residuen bevatten van 970 tot 2527 van LRRK2 12. Onlangs Daniëls et al.. Isolatie van volledige lengte LRRK2 in oplossing van menselijke embryonale niercellen gemeld, maar dit eiwit is niet op grote schaal beschikbaar 13. In tegenstelling, de GST fusie afgeknotte vorm van LRRK2 is commercieel available (van Invitrogen, zie tabel 1 voor details), en biedt een handig hulpmiddel voor het aantonen van een test voor LRRK2 kinase-activiteit. Er zijn verschillende uitgangen voor LRRK2 kinase-activiteit gemeld. Autofosforylatie van LRRK2 zelf, fosforylering van Myeline Basic Protein (MBP) als een generiek kinase ondergrond en fosforylering van een kunstmatig substraat – genaamd LRRKtide, op basis van fosforylering van threonine 558 in Moesin – zijn allen toegepast, evenals een reeks van vermeende fysiologische substraten waaronder α-synucleïne, Moesin en 4-EBP 14-17. De status van deze eiwitten als substraten voor LRRK2 blijft onduidelijk, en als zodanig het protocol hieronder beschreven zal zich richten op het gebruik van MBP als een generiek substraat, en merkt het nut van dit systeem test LRRK2 kinase-activiteit gericht tegen een scala van mogelijke ondergronden.
Protocol
Discussion
Dit artikel beschrijft een eenvoudige protocol voor het testen van de kinase-activiteit van LRRK2 met behulp van een in vitro systeem. In het belang van de beknoptheid, is dit beperkt tot een een-uur eindpunt template met behulp van een generiek substraat, maar de algemene protocol is van toepassing op een scala van mogelijke substraten en vatbaar voor meer geavanceerde analyses onderzoek naar de kinetiek van de kinase-activiteit van LRRK2 . Dit onderstreept een van de belangrijkste voordelen van het gebruik van een in vitro systeem voor het kinase gedrag van een eiwit zoals deze te onderzoeken: omdat er volledige controle over de concentraties van het enzym en substraat, is het mogelijk om kinetische gegevens te genereren en K m te berekenen en V max-waarden voor de reactie. Voor meer gedetailleerde kinetische evaluaties of evaluatie van de impact van de vermeende remmers, een hogere doorvoer systeem (zoals dat wordt geboden door het gebruik van de LRRKtide substraat, verkrijgbaar bij Invitrogen) is een superieur alternatief,ve aan de benadering die hier wordt beschreven.
Het is echter belangrijk, om te erkennen dat het reductionistische model-systeem geleverd door in-vitro-kinase assays is maar een hulpmiddel om de biologie van een kinase en de relaties met potentiële substraten te onderzoeken. Gegevens van assays zoals deze moet worden gebruikt in combinatie met andere benaderingen om een volledig beeld van hoe een kinase zich gedraagt in vitro en in een cellulaire context te krijgen. Zo kan bijvoorbeeld een vermeende substraat gefosforyleerd in vitro worden geanalyseerd met behulp van massaspectrometrie om mogelijke phosphosites die vervolgens kan worden gemanipuleerd door gerichte mutagenese (bijvoorbeeld. Omzetten van serine of threonine fosfaat acceptor residuen aan none-fosforyleerbare residuen zoals alanine) de functionele onderzoeken te identificeren de gevolgen van fosforylering ex vivo.
Een belangrijke overweging bij het interpreteren van gegevens van een in vitro test systeem zoals dit is kans op either type I of type II (vals positief of vals negatief) fouten. De reductionistische karakter van dit systeem helaas beschikt om zowel – in het geval van de voormalige, met een gezuiverde vermeende substraat en gezuiverd kinase in kunstmatig de buurt en bij hoge concentratie (in vergelijking met de cellulaire milieu) kan resulteren in artefactual fosforylatie gebeurtenissen. Omgekeerd veel kinases functie als onderdeel van een complex in het kader van de cel, en vereisen co-factoren voor fosforylatie van een bepaalde ondergrond te voorkomen. Zoals hierboven vermeld, een positief resultaat van fosforylering van een vermeende substraat met behulp van een in vitro test systeem moet vervolgens worden getest in een cellulair systeem om de resultaten te valideren, en een negatief resultaat moet met voorzichtigheid worden geïnterpreteerd.
In het licht van deze, is het essentieel waar het mogelijk om zowel de positieve en negatieve controles moeten een vergelijkend onderzoek naar de activiteit van uw kinase van belang mogelijk te maken. Zorgvuldige selectie van een positieve control dat een bekende activiteit naar uw eiwit van belang is, samen met een negatieve controle die is waarschijnlijk niet uw vermeende substraat fosforyleren, is zeer waardevol. Een kandidaat controle voor LRRK2 is Receptor interactie kinase 3, die een nauw verwante primaire sequentie moet de kinase domein van LRRK2, maar heeft een heel andere algemene domein structuur 18. Dit is beschikbaar als recombinant eiwit uit Invitrogen en wordt gebruikt als een standaard controle in ons laboratorium.
Ook moet worden opgemerkt dat de commercieel verkrijgbare vorm van LRRK2 de N-terminus van het eiwit ontbreekt en is gelabeld met glutathion-s-transferase en dit moet in aanmerking worden genomen als een potentiële verstorende factor bij het uitvoeren van kinase assays met dit eiwit, de N-terminal van LRRK2 omdat het niet bekend welke rol kunnen spelen in de normale functie van dit eiwit. Als bijvoorbeeld de N-terminale deel van de LRRK2 die afwezig is in het eiwit wordt gebruikt in dit protocolis van cruciaal belang voor de aanwerving van een specifiek substraat voor de kinase domein van LRRK2, dan zal dit een grote invloed op de waargenomen fosforylatie van het substraat in de in vitro systeem zoals hierboven beschreven.
Zelfs met deze beperkingen, echter het belang gehecht aan biologie van LRRK2 in het onderzoek van Parkinson benadrukt het nut van dit protocol als een waardevol instrument voor het onderzoeken van het gedrag van dit eiwit in een in vitro setting.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteur is een van Parkinson in het Verenigd Koninkrijk Research Fellow (subsidie F1002). Dit werk werd mede ondersteund door de Wellcome Trust / MRC Joint Call in neurodegeneratie award (WT089698) om de ziekte van het Verenigd Koninkrijk van Parkinson Consortium (UKPDC) waarvan de leden van het UCL Institute of Neurology, de Universiteit van Sheffield en de MRC Proteïne Fosforylatie Unit bij de Universiteit van Dundee.
Materials
| Reagent | Company | Catalogue Number | Comment |
| LRRK2 wild type | Invitrogen | PV4873 | |
| LRRK2 G2019S | Invitrogen | PV4881 | |
| LRRK2 D1994A | Invitrogen | PV6051 | |
| Kinase buffer | Cell Signalling | 9802S | |
| MBP | Sigma | M1891 | |
| 32P g ATP | Perkin Elmer | BLU002X500UC | 500µCi, 30Ci /mMole |
| 4x LDS sample buffer | Invitrogen | NP0007 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| Protein standards | Invitrogen | LC5800 | |
| MOPS running buffer | Invitrogen | NP0001 | |
| Bis-tris acrylamide gel | Invitrogen | NP0321 | 4-12% 1mm 10well |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| Transfer buffer | Invitrogen | NP0006 |
Table 1. Reagents
Distilled and de-ionized water was used for all dilution steps
| Equipment type | Company | Comment |
| Geiger counter | Mini Instruments | |
| SDS PAGE tank | Invitrogen | |
| Transfer tank | Invitrogen | |
| Heat blocks (2) | Eppendorf | |
| Phosphor screen | GE | X-ray film can be substituted |
| Phosphor imager | GE | |
| Exposure cassette | GE | |
| Centrifuge | Eppendorf | |
| Perspex shielding | ||
| 1.5ml tubes | VWR | Screw top with O ring |
Table 2. Equipment
References
- Lewis, P. A. The function of ROCO proteins in health and disease. Biol. Cell. 101, 183-191 (2009).
- Paisan-Ruiz, C. Cloning of the gene containing mutations that cause PARK8-linked Parkinson’s disease. Neuron. 44, 595-600 (2004).
- Zimprich, A. Mutations in LRRK2 cause autosomal-dominant parkinsonism with pleomorphic pathology. Neuron. 44, 601-607 (2004).
- West, A. B. Parkinson’s disease-associated mutations in leucine-rich repeat kinase 2 augment kinase activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102, 16842-16847 (2005).
- Gloeckner, C. J. The Parkinson disease causing LRRK2 mutation I2020T is associated with increased kinase activity. Hum. Mol. Genet. 15, 223-232 (2006).
- Lewis, P. A. The R1441C mutation of LRRK2 disrupts GTP hydrolysis. Biochem. Biophys. Res. Commun. 357, 668-671 (2007).
- Greggio, E. Kinase activity is required for the toxic effects of mutant LRRK2/dardarin. Neurobiol. Dis. 23, 329-341 (2006).
- Smith, W. W. Kinase activity of mutant LRRK2 mediates neuronal toxicity. Nat. Neurosci. 9, 1231-1233 (2006).
- Deng, X. Characterization of a selective inhibitor of the Parkinson’s disease kinase LRRK2. Nat. Chem. Biol. 7, 203-205 (2011).
- Lee, B. D. Inhibitors of leucine-rich repeat kinase-2 protect against models of Parkinson’s disease. Nat. Med. 16, 998-1000 (2010).
- Nichols, R. J. Substrate specificity and inhibitors of LRRK2, a protein kinase mutated in Parkinson’s disease. The Biochemical Journal. 424, 47-60 (2009).
- Anand, V. S. Investigation of leucine-rich repeat kinase 2: enzymological properties and novel assays. FEBS. J. 276, 466-478 (2009).
- Daniels, V. Insight into the mode of action of the LRRK2 Y1699C pathogenic mutant. Journal of Neurochemistry. 116, 304-315 (2011).
- Jaleel, M. LRRK2 phosphorylates moesin at Thr558; characterisation of how Parkinson’s disease mutants affect kinase activity. Biochem. J. , (2007).
- Qing, H., Wong, W., McGeer, E. G., McGeer, P. L. Lrrk2 phosphorylates alpha synuclein at serine 129: Parkinson disease implications. Biochem. Biophys. Res. Commun. 387, 149-152 (2009).
- Imai, Y. Phosphorylation of 4E-BP by LRRK2 affects the maintenance of dopaminergic neurons in Drosophila. Embo. J. 27, 2432-2443 (2008).
- Greggio, E. The Parkinson disease-associated leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) is a dimer that undergoes intramolecular autophosphorylation. J. Biol. Chem. 283, 16906-16914 (2008).
- Manning, G., Whyte, D. B., Martinez, R., Hunter, T., Sudarsanam, S. The protein kinase complement of the human genome. Science. 298, 1912-1934 (2002).
