Untersuchen der Kinase-Aktivität von LRRK2 In-vitro-</em
Summary
Leucin rich repeat kinase 2 ist ein großes Multidomain-Kinase, Mutationen, bei denen sind die häufigste genetische Ursache der Parkinson-Krankheit. Die Analyse der Kinase-Aktivität dieses Proteins hat sich als wichtiges Instrument für das Verständnis der Biologie und Dysfunktion des Proteins werden. In diesem Papier,<em> In-vitro-</em> Testen der Kinase-Aktivität von LRRK2 und eine Auswahl seiner Mutanten beschrieben wird, bietet ein experimentelles System zur Phosphorylierung von vermeintlichen Substraten und potenzielle Funktionsstörungen LRRK2 in Krankheit zu untersuchen.
Abstract
Leucin rich repeat kinase 2 (LRRK2) ist ein 2527 Aminosäure Mitglied der ROCO Familie von Proteinen, die über eine komplexe, Multidomain Struktur mit einem GTPase-Domäne (genannt ROC, für Ras komplexer Proteine) und eine Kinase-Domäne 1. Die Entdeckung im Jahr 2004 von Mutationen in LRRK2, dass die Parkinson-Krankheit (PD) führen führte LRRK2 wird im Mittelpunkt einer riesigen Menge von Forschung in seine normale Funktion und wie das Protein schief geht in der Krankheitszustand 2,3. Erste Untersuchungen in der Funktion des LRRK2 Schwerpunkt auf ihre enzymatische Aktivitäten 4-6. Obwohl ein klares Bild ist noch von einer konsistenten Änderung dieser durch Mutationen entstehen, hat Daten aus einer Anzahl von Gruppen die Bedeutung der Kinase-Aktivität von LRRK2 in den Zelltod in Verbindung mit Mutationen 7,8 hervorgehoben. Neuere Veröffentlichungen haben Inhibitoren gezielt die Kinaseaktivität von LRRK2 und bietet eine zentrale experimentelle Tool 9-11 gemeldet. In Anbetracht dieser Daten ist esist wahrscheinlich, dass die enzymatische Eigenschaften LRRK2 uns leisten einen wichtigen Einblick in die Biologie dieses Proteins, obwohl, ob sie mögliche Angriffspunkte für die Parkinson-sind, sei dahingestellt.
Eine Reihe unterschiedlicher Ansätze wurden verwendet, um Tests der Kinase-Aktivität von LRRK2. Zunächst wurden Tests unter Verwendung von Epitop markierte Protein in Säugetier-Zelllinien überexprimiert durchgeführt und immunpräzipitiert, mit dem Tests durchgeführt mit diesem Protein auf Agaroseperlen 4,5,7 immobilisiert. Anschließend haben gereinigten rekombinanten Fragmente LRRK2 in Lösung auch verwendet worden, zum Beispiel ein GST getaggt Fragment aus Insektenzellen, die Rückstände von 970 bis 2527 von LRRK2 12 gereinigt. In jüngster Zeit Daniels et al. Die Isolierung der vollen Länge LRRK2 in Lösung aus menschlichen embryonalen Nierenzellen berichtet, jedoch dieses Proteins ist nicht allgemein zugänglich 13. Im Gegensatz dazu abgeschnitten dem GST-Fusionsprotein Form LRRK2 ist kommerziell verfügbe (von Invitrogen, siehe Tabelle 1 für weitere Details), und bietet ein komfortables Werkzeug für den Nachweis eines Assays für LRRK2 Kinase-Aktivität. Mehrere verschiedene Ausgänge für LRRK2 Kinase-Aktivität berichtet worden. Autophosphorylierung LRRK2 selbst, die Phosphorylierung von Myelin Basic Protein (MBP) als generische Kinase-Substrat und die Phosphorylierung von einem künstlichen Substrat – genannt LRRKtide, auf die Phosphorylierung von Threonin 558 in Moesin Basis – alle wurden verwendet, da eine Reihe von vermeintlichen physiologischen Substrate einschließlich α-Synuclein, Moesin und 4-EBP 14-17. Der Status dieser Proteine als Substrate für LRRK2 bleibt unklar, und als solche den unten beschriebenen Protokoll wird zur Verwendung von MBP als generisches Substrat, in Anbetracht der Nützlichkeit dieses System Assay LRRK2 Kinase-Aktivität gegen eine Reihe von möglichen Substraten gerichtet konzentrieren.
Protocol
Discussion
Dieses Papier beschreibt eine grundlegende Protokoll zur Bestimmung der Kinase-Aktivität von LRRK2 mit einem in vitro-System. Im Interesse der Kürze hat dies zu einer einstündigen Endpunkt Vorlage mit einem generischen Substrat beschränkt, sondern dem allgemeinen Protokoll gilt für eine Reihe von möglichen Substraten und zugänglich anspruchsvollere Analysen Untersuchung der Kinetik der Kinase-Aktivität von LRRK2 . Dies unterstreicht eine der wichtigsten Vorteile der Verwendung eines in vitro Systems an die Kinase Verhalten eines Proteins, wie diese zu untersuchen: denn es gibt die volle Kontrolle über die Konzentrationen der Enzym und Substrat, ist es möglich, kinetische Daten zu generieren und zu berechnen K m und V max-Werte für die Reaktion. Für weitere detaillierte kinetische Auswertungen oder Bewertung der Auswirkungen der vermeintlichen Hemmer, ist ein höherer Durchsatz-System (wie z. B., dass durch die LRRKtide Substrat, erhältlich von Invitrogen bot) eine überlegene Alternatibereits in dem hier beschriebenen Ansatz.
Es ist jedoch wichtig, zu erkennen, dass die reduktionistische Modell-System zur Verfügung gestellt durch in vitro Kinase-Assays ist nur ein Werkzeug, um die Biologie von einer Kinase und seine Beziehungen zu potenziellen Substraten zu untersuchen. Daten aus Untersuchungen, wie diese sollte in Verbindung mit anderen Ansätzen verwendet werden, um ein umfassendes Bild davon, wie eine Kinase verhält sich in vitro und im zellulären Kontext zu gewinnen. Zum Beispiel kann ein mutmaßliches Substrat in vitro phosphoryliert durch Massenspektrometrie analysiert werden, um mögliche phosphosites, die dann durch gezielte Mutagenese (z. B.. Umwandlung von Serin oder Threonin-Phosphat-Akzeptor Rückstände none-phosphorylierbaren Rückstände wie Alanin) manipuliert werden können, um die funktionale untersuchen zu identifizieren Folgen der Phosphorylierung ex vivo.
Ein entscheidendes Kriterium bei der Interpretation von Daten aus einem in-vitro-Assay-System wie diesem ist die Wahrscheinlichkeit von either Typ I oder Typ II (false positive oder falsch-negativen) Fehler. Die reduktionistische Natur dieses System leider verfügt es sowohl – im Fall des ehemaligen, mit einem gereinigten putative Substrat und gereinigt Kinase in künstlich unmittelbarer Nähe und in hoher Konzentration (im Vergleich zu den zellulären Milieu) können in artifizielle Phosphorylierung Ereignissen führen. Umgekehrt funktionieren viele Kinasen als Teil eines komplexen im Rahmen der Zelle, und benötigen Co-Faktoren für die Phosphorylierung von einem gegebenen Substrat auftreten. Wie oben erwähnt, mit einem positiven Ergebnis von Phosphorylierung eines vermeintlichen Substrat ein in vitro Testsystem sollte dann in einem zellulären System getestet werden, um das Ergebnis zu validieren, und ein negatives Ergebnis sollte mit Vorsicht interpretiert werden.
Vor diesem Hintergrund ist es entscheidend, wo möglich, sowohl positive als auch negative Kontrollen müssen eine vergleichende Studie über die Tätigkeit der Kinase von Interesse erlauben. Sorgfältige Auswahl einer positiven control dass ein bekannter Aktivität gegenüber dem Protein von Interesse ist, zusammen mit einer Negativ-Kontrolle, die unwahrscheinlich, dass vermeintliche Substrat phosphoryliert wird, ist äußerst wertvoll. Ein Kandidat Steuerung für LRRK2 ist Rezeptor interagiert Kinase 3, die eine eng verwandte primäre Sequenz der Kinase-Domäne des LRRK2 hat aber eine ganz andere gesamten Domain-Struktur 18. Dies ist als rekombinantes Protein von Invitrogen und wird als Standard-Steuerung in unserem Labor verwendet.
Es sollte auch darauf hingewiesen, dass die kommerziell erhältliche Form von LRRK2 der N-Terminus des Proteins fehlt und ist mit Glutathion-S-transferase und dies sollte in Betracht als potenzieller Störfaktor gezogen werden, wenn die Durchführung Kinase-Assays mit diesem Protein markiert werden, da nicht bekannt ist, welche Rolle der N-terminal von LRRK2 kann in die normale Funktion dieses Proteins zu spielen. Wenn zum Beispiel der N-terminalen Teil des LRRK2, dass fehlt in dem Protein im Sinne dieses Protokollsist entscheidend für die Einstellung eines bestimmten Substrat der Kinase-Domäne des LRRK2 dann wird dies einen großen Einfluss auf die beobachteten Phosphorylierung haben das Substrat in der in vitro-System beschrieben.
Selbst mit diesen Einschränkungen jedoch unterstreicht die Bedeutung, die Biologie der LRRK2 in der Parkinson-Forschung den Nutzen dieses Protokolls als ein wertvolles Werkzeug für die Untersuchung des Verhaltens dieses Proteins in einem in vitro-Einstellung.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Der Autor ist ein Parkinson-UK Research Fellow (grant F1002). Diese Arbeit wurde zum Teil durch den Wellcome Trust / MRC Joint Call in Neurodegeneration award (WT089698) nach Großbritannien Parkinson Consortium (UKPDC), deren Mitglieder von der UCL Institute of Neurology, der University of Sheffield und der MRC Protein-Phosphorylierung Unit unterstützt der University of Dundee.
Materials
| Reagent | Company | Catalogue Number | Comment |
| LRRK2 wild type | Invitrogen | PV4873 | |
| LRRK2 G2019S | Invitrogen | PV4881 | |
| LRRK2 D1994A | Invitrogen | PV6051 | |
| Kinase buffer | Cell Signalling | 9802S | |
| MBP | Sigma | M1891 | |
| 32P g ATP | Perkin Elmer | BLU002X500UC | 500µCi, 30Ci /mMole |
| 4x LDS sample buffer | Invitrogen | NP0007 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| Protein standards | Invitrogen | LC5800 | |
| MOPS running buffer | Invitrogen | NP0001 | |
| Bis-tris acrylamide gel | Invitrogen | NP0321 | 4-12% 1mm 10well |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| Transfer buffer | Invitrogen | NP0006 |
Table 1. Reagents
Distilled and de-ionized water was used for all dilution steps
| Equipment type | Company | Comment |
| Geiger counter | Mini Instruments | |
| SDS PAGE tank | Invitrogen | |
| Transfer tank | Invitrogen | |
| Heat blocks (2) | Eppendorf | |
| Phosphor screen | GE | X-ray film can be substituted |
| Phosphor imager | GE | |
| Exposure cassette | GE | |
| Centrifuge | Eppendorf | |
| Perspex shielding | ||
| 1.5ml tubes | VWR | Screw top with O ring |
Table 2. Equipment
References
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