Dosage de l'activité kinase de LRRK2 In vitro</em
Summary
Kinase Leucine Rich Repeat 2 est une kinase multidomaine grandes, les mutations dans lesquelles sont la cause génétique la plus courante de la maladie de Parkinson. Analyse de l'activité kinase de cette protéine s'est révélée être un outil crucial dans la compréhension de la biologie et le dysfonctionnement de cette protéine. Dans ce papier,<em> In vitro</em> Dosage de l'activité kinase de LRRK2 et une sélection de ses mutants est décrite, en fournissant un système expérimental pour examiner la phosphorylation de substrats putatifs et le dysfonctionnement potentiel de LRRK2 dans la maladie.
Abstract
Kinase Leucine Rich Repeat 2 (LRRK2) est un acide aminé 2527 membres de la famille ROCO de protéines, possédant une structure complexe et multidomaine, y compris un domaine GTPase (appelé ROC pour Ras de protéines complexes) et un domaine kinase 1. La découverte en 2004 de mutations dans LRRK2 qui causent la maladie de Parkinson (MP) a abouti à LRRK2 être l'objet d'un énorme volume de recherche dans leur fonction normale et comment la protéine se passe mal dans l'état 2,3 maladie. L'enquête initiale sur la fonction de LRRK2 concentré sur ses activités enzymatiques 4-6. Même si une image claire n'a encore émerger d'une altération uniforme dans ces dues à des mutations, des données à partir d'un certain nombre de groupes a souligné l'importance de l'activité kinase de LRRK2 dans la mort cellulaire liée à des mutations 7,8. Des publications récentes ont rapporté des inhibiteurs ciblant l'activité kinase de LRRK2, fournissant un outil clé expérimentale 9-11. À la lumière de ces données, ilest probable que les propriétés enzymatiques de LRRK2 nous offrent une fenêtre importante sur la biologie de cette protéine, bien qu'ils soient des cibles potentielles de médicaments pour la maladie de Parkinson est ouvert au débat.
Un certain nombre d'approches différentes ont été utilisées pour doser l'activité kinase de LRRK2. Initialement, les analyses ont été effectuées en utilisant épitope protéine marquée surexprimé dans des lignées cellulaires de mammifères et immunoprécipité, avec les essais réalisés à l'aide de cette protéine immobilisée sur des billes d'agarose 4,5,7. Par la suite, purifié des fragments recombinants de LRRK2 dans la solution ont également été utilisés, par exemple un fragment TPS marqués purifiés à partir de cellules d'insectes contenant des résidus 970 à 2527 de la LRRK2 12. Récemment, Daniels et al. Rapporté l'isolement de la LRRK2 pleine longueur en solution à partir de cellules embryonnaires de rein, mais cette protéine n'est pas largement disponible 13. En revanche, la fusion TPS tronquée forme de LRRK2 est commercialement disponibe (de Invitrogen, voir le tableau 1 pour les détails), et fournit un outil pratique pour démontrer un dosage de l'activité kinase de LRRK2. Plusieurs sorties différentes pour LRRK2 activité de la kinase ont été signalés. Autophosphorylation de LRRK2 lui-même, la phosphorylation de la protéine de myéline de base (MBP) comme substrat kinase générique et phosphorylation d'un substrat artificiel – LRRKtide surnommé, basée sur la phosphorylation de la thréonine 558 en Moesin – ont tous été utilisés, comme l'ont fait une série de substrats physiologiques putatifs y compris les α-synucléine, Moesin et 4-EBP 14-17. Le statut de ces protéines en tant que substrats pour la LRRK2 reste incertaine, et comme tel le protocole décrit ci-dessous porteront sur l'utilisation de MBP comme substrat générique, en notant l'utilité de ce système à l'activité kinase de dosage LRRK2 dirigée contre une gamme de substrats potentiels.
Protocol
Discussion
Ce document décrit un protocole de base pour le dosage de l'activité kinase de LRRK2 en utilisant un système in vitro. Dans le souci de brièveté, ce qui a été limité à un modèle d'une heure le point final en utilisant un substrat générique, mais le protocole général est applicable à une gamme de substrats potentiels et se prêtent à des analyses plus sophistiquées examiner la cinétique de l'activité kinase de LRRK2 . Cela souligne l'un des principaux avantages d'utiliser un système in vitro pour examiner le comportement d'une protéine kinase comme celui-ci: parce qu'il ya un contrôle complet sur les concentrations de l'enzyme et le substrat, il est possible de générer des données cinétiques et de calculer K m et V les valeurs max de la réaction. Pour de plus amples évaluations détaillées cinétique ou d'évaluer l'impact des inhibiteurs putatifs, un système de débit plus élevé (tel que celui fourni en utilisant le substrat LRRKtide, disponible chez Invitrogen) est un supérieur alternative à l'approche décrite ici.
Il est important, cependant, de reconnaître que le système modèle réductionniste fournies par des essais de kinase in vitro n'est qu'un outil permettant d'examiner la biologie de la kinase et de ses relations avec les substrats potentiels. Les données provenant de tests comme celui-ci devrait être utilisé en conjonction avec d'autres approches pour obtenir une image complète de la façon dont se comporte une kinase in vitro et dans un contexte cellulaire. Par exemple, un substrat putatif phosphorylée in vitro peuvent être analysés par spectrométrie de masse pour identifier phosphosites possibles qui peuvent ensuite être manipulées par mutagenèse ciblée (par ex. Sérine ou thréonine convertissant des résidus accepteur de phosphate à aucun phosphorylable résidus tels que l'alanine) pour examiner le fonctionnement conséquences de la phosphorylation ex vivo.
Une considération clé dans l'interprétation des données d'un système de test in vitro, comme cela est probable d'eitheR type I ou II (faux positif ou faux négatif) des erreurs. Le caractère réductionniste de ce système dispose malheureusement il à la fois – dans le cas de l'ancien, ayant un substrat purifiés putative kinase et purifié à proximité artificiellement étroite et à forte concentration (par rapport au milieu cellulaire) peuvent entraîner des événements de phosphorylation artéfactuelle. Inversement, de nombreuses kinases fonctionner comme partie d'un complexe dans le contexte de la cellule, et nécessitent des co-facteurs de la phosphorylation d'un substrat donné de se produire. Comme indiqué précédemment, un résultat positif de la phosphorylation d'un substrat putatif utilisant un système de dosage in vitro doivent ensuite être testés dans un système cellulaire pour valider le résultat, et un résultat négatif doit être interprété avec prudence.
Dans cette optique, il est essentiel, si possible d'avoir des contrôles positifs et négatifs afin de permettre une étude comparative de l'activité kinase de votre intérêt. Une sélection rigoureuse d'un contro positifsL qui a une activité connue vers votre protéine d'intérêt, avec un contrôle négatif qui est peu probable de phosphoryler votre substrat putatif, est extrêmement précieux. Un candidat pour le contrôle LRRK2 est un récepteur kinase interagissant 3, qui a une séquence étroitement liés aux primaires du domaine kinase de LRRK2 mais a une structure très différente de domaine global 18. Ceci est disponible en tant que protéine recombinante chez Invitrogen et est utilisé comme un contrôle standard dans notre laboratoire.
Il convient également de noter que le formulaire disponible dans le commerce de la LRRK2 manque la N-terminale de la protéine et est étiqueté avec la glutathion-S-transférase et cela devrait être pris en considération comme un facteur potentiel de confusion lors de la réalisation des essais avec cette protéine kinase, comme on ne sait pas quel rôle la N-terminale de LRRK2 pourraient jouer dans la fonction normale de cette protéine. Si, par exemple, la partie N-terminale de LRRK2 qui est absente dans la protéine utilisée dans le présent protocoleIl est essentiel pour le recrutement d'un substrat spécifique au domaine kinase de LRRK2 alors cela aura un impact majeur sur la phosphorylation observée de ce substrat dans le système in vitro décrit ci-dessus.
Même avec ces réserves, cependant, l'importance attachée à la biologie de LRRK2 dans la recherche de Parkinson souligne l'utilité de ce protocole comme un outil précieux pour étudier le comportement de cette protéine dans une dans la mise en vitro.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
L'auteur est un de Parkinson britannique Research Fellow (bourse F1002). Ce travail a été soutenu en partie par le Wellcome Trust / MRC Appel conjoint dans l'attribution neurodégénérescence (WT089698) au Consortium la maladie de Parkinson du Royaume-Uni (UKPDC) dont les membres proviennent de l'Institut UCL de la neurologie, de l'Université de Sheffield et l'unité MRC Protein Phosphorylation au l'Université de Dundee.
Materials
| Reagent | Company | Catalogue Number | Comment |
| LRRK2 wild type | Invitrogen | PV4873 | |
| LRRK2 G2019S | Invitrogen | PV4881 | |
| LRRK2 D1994A | Invitrogen | PV6051 | |
| Kinase buffer | Cell Signalling | 9802S | |
| MBP | Sigma | M1891 | |
| 32P g ATP | Perkin Elmer | BLU002X500UC | 500µCi, 30Ci /mMole |
| 4x LDS sample buffer | Invitrogen | NP0007 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| Protein standards | Invitrogen | LC5800 | |
| MOPS running buffer | Invitrogen | NP0001 | |
| Bis-tris acrylamide gel | Invitrogen | NP0321 | 4-12% 1mm 10well |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| Transfer buffer | Invitrogen | NP0006 |
Table 1. Reagents
Distilled and de-ionized water was used for all dilution steps
| Equipment type | Company | Comment |
| Geiger counter | Mini Instruments | |
| SDS PAGE tank | Invitrogen | |
| Transfer tank | Invitrogen | |
| Heat blocks (2) | Eppendorf | |
| Phosphor screen | GE | X-ray film can be substituted |
| Phosphor imager | GE | |
| Exposure cassette | GE | |
| Centrifuge | Eppendorf | |
| Perspex shielding | ||
| 1.5ml tubes | VWR | Screw top with O ring |
Table 2. Equipment
References
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