Assaying פעילות קינאז של LRRK2 במבחנה</em
Summary
קינאז leucine חזור ריץ' 2 הוא קינאז multidomain גדול, מוטציות שהן הגורם הגנטי השכיח ביותר של מחלת פרקינסון. ניתוח של פעילות קינאז של החלבון הזה הוכיחה להיות כלי חיוני בהבנת הביולוגיה תפקוד של חלבון זה. במאמר זה,<em> במבחנה</em> Assaying פעילות קינאז של LRRK2 ומבחר מוטנטים שלה מתואר, המספקת מערכת הניסוי לבחון זירחון של מצעים המשוערת וכשל פוטנציאלי של LRRK2 במחלה.
Abstract
קינאז leucine חזור ריץ' 2 (LRRK2) הוא חבר 2527 חומצת אמינו המשפחה Roco של חלבונים, בעלת מבנה מורכב, multidomain כולל תחום GTPase (המכונה ROC, עבור ראס של חלבונים מורכבים) ואת תחום kinase 1. הגילוי בשנת 2004 של מוטציות הגורמות LRRK2 מחלת הפרקינסון (PD) הביא LRRK2 להיות המוקד של נפח עצום של מחקר על תפקוד תקין שלה ואיך החלבון משתבש במצב מחלה 2,3. חקירה ראשונית לתוך הפונקציה של LRRK2 התמקדה הפעילות האנזימטית שלו 4-6. למרות תמונה ברורה טרם לצוץ של שינוי עקבי אלה עקב מוטציות, נתונים ממספר קבוצות הדגיש את החשיבות של פעילות קינאז של LRRK2 מוות של תאים המקושרים מוטציות 7,8. פרסומים אחרונים מדווחים מעכבי מיקוד פעילות קינאז של LRRK2, מתן כלי ניסיוני מפתח 9-11. לאור נתונים אלה,סביר להניח כי המאפיינים האנזימטית של LRRK2 להרשות לנו חלון חשוב לתוך הביולוגיה של חלבון זה, אף אם הם מטרות תרופה פוטנציאל פרקינסון פתוח לדיון.
מספר גישות שונות שימשו assay פעילות קינאז של LRRK2. בתחילה, מבחני בוצעו באמצעות חלבון מתויג epitope overexpressed שורות תאים יונקים immunoprecipitated, עם מבחני שבוצעו באמצעות חלבון משותקת על חרוזים agarose 4,5,7. לאחר מכן, מטוהרים שברי רקומביננטי של LRRK2 בתמיסה יש גם שימש, למשל קטע GST מתויג מטוהרים מתאי חרקים המכיל שאריות 970-2527 של LRRK2 12. לאחרונה, דיווחו דניאלס et al. בידודה של LRRK2 באורך מלא בתמיסה של האדם תאים עובריים כליה, אך חלבון זה אינו זמין נרחב 13. לעומת זאת, היתוך GST חתוכים בצורת LRRK2 הוא availabl מסחריתדואר (מ Invitrogen, ראה טבלה 1 לפרטים נוספים), והיא מספקת כלי נוח עבור הוכחת assay לפעילות LRRK2 קינאז. יציאות שונות על פעילות קינאז LRRK2 דווחו. Autophosphorylation של LRRK2 עצמו, זירחון של חלבון המיאלין הבסיסי (MBP) בתור מצע קינאז זירחון גנריים של מצע מלאכותי – LRRKtide המכונה, בהתבסס על זירחון של תראונין 558 ב Moesin – כל שימשו, כפי שיש בסדרה של מצעים פיזיולוגיים המשוערת כולל α-synuclein, Moesin ו 4-EBP 14-17. מעמדו של החלבונים האלה כמו מצעים עבור LRRK2 עדיין לא ברור, וככזה פרוטוקול המתואר להלן יתמקד באמצעות MBP כמו מצע גנריות, וציין את תוכנית השירות של מערכת זו על פעילות קינאז LRRK2 assay כנגד מגוון רחב של מצעים פוטנציאליים.
Protocol
Discussion
מאמר זה מתאר את פרוטוקול הבסיסי assaying פעילות קינאז של LRRK2 שימוש במערכת במבחנה. ב את האינטרסים של קוצר, זה הוגבל תבנית של שעה סיום נקודת באמצעות מצע כללי, אבל כללי הפרוטוקול חל על מגוון רחב של מצעים פוטנציאליים מקובל ניתוחים מתוחכמים יותר לבחון את הקינטיקה של פעילות קינאז של LRRK2 . זה מדגיש את אחד היתרונות העיקריים של שימוש במערכת חוץ גופית כדי לבחון את התנהגות קינאז של חלבונים כגון זה: כי יש שליטה מלאה על הריכוזים של האנזים ואת המצע, ניתן להפיק נתונים הקינטית לחשב K מ ' ו-V max ערכי התגובה. עבור הערכות הקינטית מפורט יותר או להעריך את ההשפעה של מעכבי המשוערת, מערכת תפוקה גבוהה יותר (כמו זו הניתנת באמצעות המצע LRRKtide, זמינים Invitrogen) הוא alternati מעולהיש לפנות המתואר כאן.
חשוב, עם זאת, להכיר בכך מודל רדוקציוניסט מערכת שמספקת ב מבחני חוץ גופית kinase הוא רק אחד הכלים לבחון את הביולוגיה של קינאז והיחסים שלה עם מצעים פוטנציאליים. מנתוני מבחני כגון זה יש להשתמש בשילוב עם גישות אחרות כדי לקבל תמונה מקיפה של כמה קינאז מתנהג במבחנה בהקשר הסלולר. לדוגמה, מצע המשוערת phosphorylated במבחנה ניתן לנתח על ידי ספקטרומטריית מסה לזהות phosphosites ייתכן כי לאחר מכן ניתן לטפל על ידי mutagenesis ממוקד (למשל. סרין או תראונין המרת acceptor פוספט שאריות במעלה-phosphorylatable שאריות כמו אלאנין) כדי לבחון את תפקודי ההשלכות של vivo לשעבר זרחון.
שיקול מרכזי בפרשנות נתונים ממערכת חוץ גופית ב assay כגון זה הסבירות either סוג I או מסוג II (חיובי או שלילי שקר שקר) שגיאות. אופי הרדוקציוניסטית של מערכת זו למרבה הצער נפטר אותו שניהם – במקרה של לשעבר, בעל המצע המשוערת מטוהרים מטוהרים קינאז בסמיכות מלאכותי בריכוז גבוה (לעומת הסביבה התאית) יכול לגרום לאירועים זירחון artefactual. לעומת זאת, קינאזות רבים לתפקד כחלק ממכלול בהקשר של התא, דורשים שיתוף הגורמים זירחון של מצע מסוים להתרחש. כפי שצוין לעיל, תוצאה חיובית של זירחון של מצע המשוערת שימוש במערכת assay במבחנה אז צריך להיבדק במערכת התאית כדי לאמת את התוצאה, וגם תוצאה שלילית יש לפרש בזהירות.
לאור זאת, חשוב היכן ניתן לקבל בקרות חיוביות ושליליות כדי לאפשר מחקר השוואתי של פעילות קינאז העניין שלך. בחירה קפדנית של contro חיוביתאני בעל פעילות ידועה כלפי חלבון העניין שלך, יחד עם שליטה שלילית כי סביר phosphorylate המצע המשוערת שלך, הוא יקר מאוד. אחת לשלוט מועמד LRRK2 הוא קולטן אינטראקציה kinase 3, שבה יש רצף העיקרי קשור קשר הדוק לתחום קינאז של LRRK2 אבל יש מבנה שונה מאוד תחום הכולל 18. זה זמין כמו חלבון רקומביננטי מ Invitrogen והוא משמש כביקורת רגילה במעבדה שלנו.
ראוי גם לציין כי טופס זמינים מסחרית של LRRK2 חסרה את N-הסופית של החלבון ואת מתויג גלוטתיון-s-transferase ואת זה צריך להילקח בחשבון כגורם פוטנציאלי בלבול בעת ביצוע מבחני קינאז עם חלבון זה, כמו לא ידוע מה התפקיד של N-מסוף LRRK2 עשוי לשחק בתפקוד התקין של חלבון זה. אם, למשל, את החלק של N-מסוף LRRK2 כי הוא נעדר החלבון משמש פרוטוקול זההוא קריטי עבור גיוס של מצע מסוים לתחום קינאז של LRRK2 אז זו תהיה השפעה גדולה על זירחון הנצפה אמר המצע של מערכת חוץ גופית שתוארו לעיל.
למרות אזהרות אלה, לעומת זאת, ייחסו חשיבות הביולוגיה של LRRK2 במחקר פרקינסון מדגיש את התועלת של פרוטוקול זה ככלי בעל ערך חוקרת את ההתנהגות של חלבון זה במסגרת חוץ גופית.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
הכותב הוא בריטניה פרקינסון עמית מחקר (מענק F1002). עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי התקשר Wellcome Trust / MRC משותפות הפרס ניוון מוחיים (WT089698) כדי Consortium מחלת פרקינסון בריטניה (UKPDC) שחבריה הם ממכון UCL לנוירולוגיה, אוניברסיטת שפילד ואת זרחון חלבון MRC יחידת בבית מאוניברסיטת דנדי.
Materials
| Reagent | Company | Catalogue Number | Comment |
| LRRK2 wild type | Invitrogen | PV4873 | |
| LRRK2 G2019S | Invitrogen | PV4881 | |
| LRRK2 D1994A | Invitrogen | PV6051 | |
| Kinase buffer | Cell Signalling | 9802S | |
| MBP | Sigma | M1891 | |
| 32P g ATP | Perkin Elmer | BLU002X500UC | 500µCi, 30Ci /mMole |
| 4x LDS sample buffer | Invitrogen | NP0007 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| Protein standards | Invitrogen | LC5800 | |
| MOPS running buffer | Invitrogen | NP0001 | |
| Bis-tris acrylamide gel | Invitrogen | NP0321 | 4-12% 1mm 10well |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| Transfer buffer | Invitrogen | NP0006 |
Table 1. Reagents
Distilled and de-ionized water was used for all dilution steps
| Equipment type | Company | Comment |
| Geiger counter | Mini Instruments | |
| SDS PAGE tank | Invitrogen | |
| Transfer tank | Invitrogen | |
| Heat blocks (2) | Eppendorf | |
| Phosphor screen | GE | X-ray film can be substituted |
| Phosphor imager | GE | |
| Exposure cassette | GE | |
| Centrifuge | Eppendorf | |
| Perspex shielding | ||
| 1.5ml tubes | VWR | Screw top with O ring |
Table 2. Equipment
References
- Lewis, P. A. The function of ROCO proteins in health and disease. Biol. Cell. 101, 183-191 (2009).
- Paisan-Ruiz, C. Cloning of the gene containing mutations that cause PARK8-linked Parkinson’s disease. Neuron. 44, 595-600 (2004).
- Zimprich, A. Mutations in LRRK2 cause autosomal-dominant parkinsonism with pleomorphic pathology. Neuron. 44, 601-607 (2004).
- West, A. B. Parkinson’s disease-associated mutations in leucine-rich repeat kinase 2 augment kinase activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102, 16842-16847 (2005).
- Gloeckner, C. J. The Parkinson disease causing LRRK2 mutation I2020T is associated with increased kinase activity. Hum. Mol. Genet. 15, 223-232 (2006).
- Lewis, P. A. The R1441C mutation of LRRK2 disrupts GTP hydrolysis. Biochem. Biophys. Res. Commun. 357, 668-671 (2007).
- Greggio, E. Kinase activity is required for the toxic effects of mutant LRRK2/dardarin. Neurobiol. Dis. 23, 329-341 (2006).
- Smith, W. W. Kinase activity of mutant LRRK2 mediates neuronal toxicity. Nat. Neurosci. 9, 1231-1233 (2006).
- Deng, X. Characterization of a selective inhibitor of the Parkinson’s disease kinase LRRK2. Nat. Chem. Biol. 7, 203-205 (2011).
- Lee, B. D. Inhibitors of leucine-rich repeat kinase-2 protect against models of Parkinson’s disease. Nat. Med. 16, 998-1000 (2010).
- Nichols, R. J. Substrate specificity and inhibitors of LRRK2, a protein kinase mutated in Parkinson’s disease. The Biochemical Journal. 424, 47-60 (2009).
- Anand, V. S. Investigation of leucine-rich repeat kinase 2: enzymological properties and novel assays. FEBS. J. 276, 466-478 (2009).
- Daniels, V. Insight into the mode of action of the LRRK2 Y1699C pathogenic mutant. Journal of Neurochemistry. 116, 304-315 (2011).
- Jaleel, M. LRRK2 phosphorylates moesin at Thr558; characterisation of how Parkinson’s disease mutants affect kinase activity. Biochem. J. , (2007).
- Qing, H., Wong, W., McGeer, E. G., McGeer, P. L. Lrrk2 phosphorylates alpha synuclein at serine 129: Parkinson disease implications. Biochem. Biophys. Res. Commun. 387, 149-152 (2009).
- Imai, Y. Phosphorylation of 4E-BP by LRRK2 affects the maintenance of dopaminergic neurons in Drosophila. Embo. J. 27, 2432-2443 (2008).
- Greggio, E. The Parkinson disease-associated leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) is a dimer that undergoes intramolecular autophosphorylation. J. Biol. Chem. 283, 16906-16914 (2008).
- Manning, G., Whyte, D. B., Martinez, R., Hunter, T., Sudarsanam, S. The protein kinase complement of the human genome. Science. 298, 1912-1934 (2002).
