LRRK2のキナーゼ活性を測定する in vitroで</em

安全性 以下に記述されたプロトコルは、ATPがLRRK2のキナーゼ活性に従うようにγのリン酸の位置にある放射性32 Pで標識利用しています。それは材料と正確な条件は機器やプロトコルなどのガイドとして取られるべきである我々の研究室で使用される標準のプロトコルに基づいており、そのゲルの実行などの処理の手順の多くに関して、 とceteraウェスタンブロットされこれらのプロセスで使用されるには、研究室から研究室に異なります。電離放射線放出する同位元素を含む化合物は、機関と国レベルで人間の健康と厳格なライセンシングと規制への潜在的に有害であり、その使用を制御します。このプロトコルでの実験は、（ガイドラインAVA大学での安全性サービスによって提供された優良試験所の診療ガイドラインカレッジロンドン大学のオープンソースの放射線利用の訓練に続いて、以下を実施したでilable http://www.ucl.ac.uk/estates/safetynet/training/glp_hurs.pdf ）。オープンソースの放射線の使用は、適切な訓練と規制当局の承認の前に実行しないでください。実験室研究におけるオープンソースの放射線の責任規制機関は、国によって異なる。これらの例は次のとおりです。イギリスで、安全衛生執行（ http://www.hse.gov.uk/radiation/ionising/index.htm米国では）、原子力規制委員会は、（ http://のwww.nrc.gov /素材/ミオー/ regsは-ガイド- comm.html ）、カナダカナダ原子力安全委員会（でhttp://nuclearsafety.gc.ca/eng/ ）、およびドイツダスBundesamtこだわりStrahlenschutzで（ HTTP ：/ / www.bfs.de /解除/ BFS ）。他の国のユーザーはそれらの放射線安全管理者とローカルルール、規制とライセンシング機関を確認する必要があります。このプロトコルに関連する安全上の注意は、放射性三つ葉形のシンボルを強調表示、テキストに記載されている（ ）。 1。キナーゼ反応の準備すべての反応混合物は、放射能のまん延を防ぐために、Oリングが含まれているスクリューキャップと1.5ミリリットルのサンプルチューブに用意。 氷上で融解蛋白質 – LRRK2野生型、D1994A、G2019S。 氷上で反応を作る – 10nmのLRRK2、水で50μlのために作ら0.5μg/μlMBP、10 ×キナーゼバッファーの5UL、。 2。アッセイを実行する 32 P ATPを利用するすべてのステップは、pを取る必要があります指定された放射線地域でのレース。 適切な個人用保護具を着用してください – 私たちの研究室での標準業務手順書の下で、これらは白衣、二重手袋および保護眼鏡を含む。 32 P ATPを含む試料を曝露を最小限にするために、6ミリメートルパースペックスの画面でユーザから遮蔽する必要があります。 適用可能な、個人的な監視装置を使用する必要がどこに – UCL内で、任意の認定されたオープンソースの放射線のユーザーは、実験中の放射線被ばくを監視するためのフィルムバッジを持っている必要があります。 すべての実験的な面は、芸を使って使用前と使用後の放射能汚染のために評価すべきであるドイツカウンタ。 すべての汚染の可能性のある消耗品は、放射性廃棄物処分のための制度のガイドラインを厳守で処分されるべきである。 アッセイを始める前に、° Cおよび100 ° Cをそれぞれ30に加熱ブロックを設定する -20フリーザー（保管条件は、往復32 P ATPが使用されてradionucleotidesの供給者またはタイプによって異なる場合があることに注意）から32 P ATPを削除します。 パースペックス画面の後ろに解凍、使用前に容器の外にスキャンする。 氷上で反応して、冷たいATPの10μMと共に、それぞれに32 P ATPの1μlを加える。 ピペットでよく混ぜる。 パルスは、汚染のリスクを最小限に抑え、チューブの底に液体持って遠心。 ゼロ時間のポイントの15μlアリコートを削除するD 100 4X SDSサンプルバッファーと変性5μlの添加による一定量の反応℃で10分間を終了。 パルスは、汚染のリスクを最小限に抑え、チューブの底に液体持って遠心。 残りのサンプルでは、​​加熱ブロック内に配置し、60分間30℃でインキュベート。 15μlの100 4X SDSサンプルバッファーと変性5μlの中に加え℃で10分間で終了して60分の時点と反応で除去する。 パルスは、汚染のリスクを最小限に抑え、チューブの底に液体持って遠心。 3。サンプルを免疫ブロッティングし、結果を分析 SDS – PAGE上で動作するサンプル 10も4から12パーセントビス – トリスのポリアクリルアミドゲルは、MOPS泳動バッファーを用いて電気泳動のために準備。 各サンプルの20μlのはシャープの7μlと一緒にゲル上にロードTainのタンパク質標準はしご。 ゲルは、90分間160Vで動作、または色素フロントがゲルの端に達するまで。 放射性同位体と接触するすべての液体は、放射性廃棄物として扱われ、制度的なガイドラインに従って廃棄してください。液体放射性廃棄物が大量の水で指定された放射性廃棄ヒートシンクを下に注ぐことによって破棄されなければなりませんUCL規制状態。 タンパク質はウェスタンブロットを経由して PVDF膜に転写した。 転送バッファは、1 ×トリスグリシンを加えた20％のメタノールを準備した。 PVDFメンブレン、ろ紙、ゲルのサイズを修正するためにカットし、ろ紙の場合の転送バッファを有する膜またはプリウェットの場合には氷河のメタノールで活性化。膜は、配向性の識別を可能にするためにボールペンインクであらかじめ標識する必要があります。 ゲルプラストから削除ICケーシングと過剰アクリルアミドは、放射性廃棄物として除去し、処分。 ゲルは、気泡が膜とゲルの間に存在しないことを確実に、メンブレンおよびフィルターペーパーでサンドイッチ状に形成し、ゲルとアノードとの間の膜とウェスタンブロット装置内に配置する必要があります。 転送は、16時間25Vで実施。 PVDFに蛋白質の転送に続いて、メンブレンを室温で乾燥させる。最後に、乾燥した膜は酢酸セルロースシートの間に分離し、蛍光体の画面または放射性標識タンパク質の検出を可能にするためにX線フィルムのいずれかに公開される必要があります。露光時間は、使用される放射性同位元素と反応の酵素反応速度の比活性に応じて週にわたって、数時間から実行することができます。 Phosphoscreenは、処理/フィルムをスキャン。蛍光体の画面を使用している場合、画像はフィルムを使用する場合はその後結果トランジェント、高解像度のTIFFまたはビットマップファイルとして保存する必要がありますsparencyは、デスクトップスキャナを使用してスキャンし、高解像度のTIFFまたはビットマップファイルとして保存する必要があります。イメージは、ImageJの、健康のウェブサイトの国立研究所（上で利用可能なフリーウェアのプログラムで解析することができますhttp://rsbweb.nih.gov/ij/ ）。 4。代表的な結果図1は、アッセイの一般的なリン酸受容体基質としてミエリン塩基性タンパク質と野生型、G2019SとD1994A LRRK2を用いて行うための代表的な結果を示しています。 LRRK2の自己リン酸化は20 – 40kDaから見えるリン酸化MBPを表す複数のバンドで、≈200kDaで表示されます。 D1994A（キナーゼデッド）レーンでの自己リン酸化の有無に注意してください、と原因G2019S変異にリン酸化を増加。キナーゼデッド車線でもMBPの残留リン酸化に注意してください。これは、D1994A変異によるLRRK2のキナーゼ活性の不完全なアブレーションによるものやプレゼンスOを反映しているのかもしれないfは反応の汚染キナーゼをトレース。 図1。