Ensayo de la actividad quinasa de LRRK2 In vitro</em

Seguridad El protocolo se describe a continuación utiliza ATP marcado con 32 P radiactivo en la posición del fosfato γ para seguir la actividad de la quinasa de LRRK2. Se basa en los protocolos estándar utilizados en nuestro laboratorio, y por lo tanto con respecto a muchos de los pasos en el proceso como la ejecución de los geles, el Western Blot et cetera los materiales y las condiciones precisas se debe tomar como guía los equipos y protocolos utilizados para estos procesos varían de un laboratorio a otro. Los compuestos que contienen isótopos que emiten radiaciones ionizantes son potencialmente dañinos para la salud humana y las licencias y regulaciones estrictas en un control de nivel institucional y nacional de su uso. Los experimentos en este protocolo se llevaron a cabo después del entrenamiento en el uso de radiación de la fuente abierta en el University College de Londres y siguiendo las directrices de buenas prácticas de laboratorio proporcionados por los servicios de seguridad en el colegio (directrices available en http://www.ucl.ac.uk/estates/safetynet/training/glp_hurs.pdf ). El uso de la radiación de código abierto no debe ser intentado antes de la formación adecuada y la aprobación regulatoria. El organismo regulador responsable de la radiación de fuentes abiertas en la investigación de laboratorio varía de país a país. Ejemplos de estos son: en el Reino Unido, la Health and Safety Executive ( http://www.hse.gov.uk/radiation/ionising/index.htm ), en los Estados Unidos la Comisión Reguladora Nuclear ( http:// www.nrc.gov / materiales / miau / reglas-guías comm.html- ), en Canadá la Comisión Canadiense de Seguridad Nuclear ( http://nuclearsafety.gc.ca/eng/ ), y en Alemania Das Bundesamt für Strahlenschutz ( http : / / www.bfs.de / de / BFS ). Usuarios de otros países deben confirmar las reglas, los reglamentos y autoridades que otorgan licencias con el oficial de seguridad radiológica. Precauciones de seguridad pertinentes para este protocolo se han observado en el texto, resaltado con el símbolo del trébol radiactivo ( ). 1. Preparación de las reacciones de quinasa Todas las mezclas de reacción preparada en tubos de muestra de 1,5 ml con tapón de rosca que contiene una junta tórica para evitar la propagación de la radiactividad. Descongele la proteína en el hielo – LRRK2 de tipo salvaje, D1994A, G2019S. constituyen una reacción en el hielo – 10 nM LRRK2, 0.5μg/μl MBP, 5UL de tampón quinasa 10X, compuesto de 50μl con agua. 2. Al realizar el análisis Todos los pasos que utilizan 32 P ATP debe tomar pencaje en las áreas designadas de radiación. Equipo de protección personal se debe usar – en un procedimiento operativo estándar en nuestro laboratorio que incluyen bata de laboratorio, guantes dobles y gafas protectoras. Las muestras que contienen 32 P ATP debe ser protegido de los usuarios de pantallas de metacrilato de 6 mm para minimizar la exposición. Cuando se utilicen dispositivos de aplicación, el seguimiento personal debe ser utilizado – en la UCL, cualquier certificado de usuario abierta la radiación de origen debe tener una placa de cine para monitorear exposición a la radiación durante los experimentos. Todas las superficies experimentales se debe evaluar la contaminación radiactiva antes y después de su uso mediante un Geiger contra. Todos los consumibles potencialmente contaminados deben ser eliminados en estricto apego a las directrices institucionales para la eliminación de los residuos radiactivos. Antes de comenzar la prueba, establecer bloques de calentamiento a 30 ° C y 100 ° C, respectivamente, Retire 32 P ATP a partir de congelador a -20 (tenga en cuenta que las condiciones de almacenamiento de aquí para allá 32 P ATP puede variar en función de proveedor o el tipo de radionucleótidos se utiliza). exploración fuera del contenedor antes de su uso, descongelar detrás de la pantalla de metacrilato. Con las reacciones en el hielo, añadir 1μl de 32 P ATP a cada junto con 10μM de ATP frío. Mezclar bien con la pipeta. Centrífuga de pulso para llevar líquido a la parte inferior del tubo, reduciendo al mínimo el riesgo de contaminación. Quitar alícuota 15μl de punto cero del tiempo unad terminar la reacción de parte alícuota de la adición de 5μl de tampón de muestra SDS 4x y desnaturalización a 100 ° C durante 10 minutos. Centrífuga de pulso para llevar líquido a la parte inferior del tubo, reduciendo al mínimo el riesgo de contaminación. Resto de la muestra colocada en el bloque de calentamiento y se incuba a 30 ° C durante 60 minutos. 15μl retirado a los 60 minutos de tiempo y punto de terminar la reacción mediante la adición de 5μl de tampón de muestra SDS 4x y desnaturalización a 100 ° C durante 10 minutos. Centrífuga de pulso para llevar líquido a la parte inferior del tubo, reduciendo al mínimo el riesgo de contaminación. 3. Inmunotransferencia las muestras y el análisis de los resultados Muestras analizadas por SDS-PAGE 10 y 12.4% Bis-Tris gel de poliacrilamida preparados para electroforesis con buffer MOPS funcionamiento. 20μl de cada muestra cargada en gel junto con 7μl de objetos punzantesmantener escalera cantidad estándar de proteínas. Gel funcionar a 160V durante 90 minutos, o hasta que frente tinte ha llegado al final del gel. Todo el líquido en contacto con radioisótopos deben ser tratados como residuos radiactivos y eliminados de las directrices institucionales de acuerdo. Regulaciones estatales UCL que los residuos radiactivos líquidos deben ser desechados mediante el vertido de abajo designado fregaderos de desechos radiactivos con abundante agua. Proteínas transferidas a una membrana de PVDF a través de Western blot. Tampón de transferencia preparada, 1x Tris glicina y un 20% de metanol. Membrana de PVDF y papel de filtro cortado al tamaño correcto para el gel y se activa con metanol de los glaciares en el caso de la membrana o humedecer previamente con tampón de transferencia en el caso del papel de filtro. La membrana debe ser pre-marcado con tinta de bolígrafo para permitir la identificación de la orientación. Gel retirado de plastIC carcasa y el exceso de acrilamida retirados y eliminados como residuo radiactivo. El gel debe ser formado en un sándwich con la membrana y el papel de filtro, asegurando que no existen burbujas entre la membrana y el gel, y luego dispuestos en el aparato de Western blot con la membrana entre el gel y el ánodo. Transferencia realizada a 25V durante 16 horas. Después de la transferencia de proteínas a PVDF, la membrana se debe secar a temperatura ambiente. Finalmente, la membrana en seco deben ser aislados entre las hojas de acetato de celulosa y se expone a cualquiera de una pantalla de fósforo o de película de rayos X para permitir la detección de la proteína marcada radiactivamente. Tiempo de exposición puede ejecutar de varias horas a más de una semana dependiendo de la actividad específica del radioisótopo utilizado y la cinética enzimática de la reacción. Phosphoscreen escaneados / película procesada. Si se utiliza una pantalla de fósforo, la imagen debe ser guardado como un archivo TIFF de alta resolución o un archivo de mapa de bits, si se utiliza película entonces la resultante transiciónsparency deben ser escaneados con un escáner de escritorio y guarda como un archivo TIFF de alta resolución o un archivo de mapa de bits. La imagen puede ser analizada en ImageJ, un programa gratuito disponible en el sitio web de los Institutos Nacionales de Salud ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ ). 4. Resultados representante La figura 1 muestra los resultados representativos de un ensayo llevado a cabo utilizando el tipo salvaje, y LRRK2 G2019S D1994A con proteína básica de mielina como sustrato aceptor de fosfato de genéricos. Autofosforilación de LRRK2 es visible en ≈ 200kDa, con múltiples bandas que representan a MBP fosforilada visible a partir del 20-40kDa. Nótese la ausencia de autofosforilación en el D1994A (quinasa muertos) de carril, y el aumento de la fosforilación debido a la mutación G2019S. Tenga en cuenta también la fosforilación de residuos de MBP en el carril de muertos quinasa. Esto puede ser debido a la ablación incompleta de la actividad quinasa de LRRK2 por el mutante D1994A o reflejar la presencia of rastro contaminante quinasas en la reacción. Figura 1.