Bağışık yetmezliği olan farelere Biyomühendislik İnsan Mikrovasküler Ağları

1. Hazırlık EGM-2 orta boy (500 ml) Fetal sığır serumu (FBS) 100 mL, 395 mL (EBM-2) Endotelyal Bazal Orta ekleyin. 100x Glutamin-penisilin-streptomisin çözüm (GPS) 5 ml ekleyin. Hidrokortizon (yani, VEGF, hFGF-B, R-IGF-1, hEGF, heparin, askorbik asit ve GA-1000) dışında tüm EGM-2 SingleQuots takviyeleri ekleyin. Filtre 0.2 mikron gözenek boyutu vakum filtre ile sterilize edilmiş. MSCGM orta (500 ml) 100x GPS Mezenkimal Kök Hücre Bazal Orta (MSCBM) 440 ml 5 ml ekleyin. MSCGM SingleQuots kiti tüm içerik ekleyin. EGM-2 SingleQuots takviyeleri hFGF-B kısım ekleyin. Filtre 0.2 mikron gözenek boyutu vakum filtre ile sterilize edilmiş. DMEM orta (500 ml) Fetal sığır serumu (FBS) 50 ml, 440 ml 1x yüksek glukoz Dulbecco'nun Modifiye Kartal Medium (DMEM) ekleyin. 100x GPS 5 ml ekleyin. Gerekli olmayan amino asit çözeltisi 5 ml ekleyin. Filtre 0.2 mikron gözenek boyutu vakum filtre ile sterilize edilmiş. Kollajen / fibronektin solüsyonu (enjeksiyon yapılan aynı gün 3.6 mL) 10x DMEM 0.4 mL distile H 2 O. 150 mcL ekleyin 1M Hepes 100 mcL (son 25 mM) ekleyin. Dikkatle, sığır kollajen 2.4 ml (5 mg / ml stok, 3 mg / ml son) ekleyin ve buz üzerinde hafifçe karıştırın. (Yaklaşık 30 mcL) 1N NaOH çözeltisi ekleyerek nötr pH ayarlayın. Nötr pH değerlendirmek için fenol kırmızı gösterge kullanın; alternatif pH izlemek için pH test kağıdı kullanabilirsiniz. (30 mg / ml son 1 mg / ml stok) insan fibronektin 120 mcL ekle FBS 0.4 mL (% 10 final) kullanana kadar buz üzerinde çözüm tutmak. Fibrinojen solüsyonu (enjeksiyon yapılan aynı gün 1 ml) Toz fibrinojen 30 mg 1 ml 0.9N NaCl (pH 7.4) solüsyonu (30 mg / ml nihai) ekleyin. Kullanmadan önce, 37 fibrinojen solüsyonu inkübe ° C 30 dakika boyunca. Önce kollajen / fibronektin jel Ayrıca, vorteks, hafifçe karıştırın. Trombin solüsyonu (200 ml) % 0.9 NaCl normal tuzlu su (50 U / ml) 200 ml toz trombin 1 KU ekleyin. Kullanana kadar -20 ° C'de 0.2 mikron gözenek boyutu şırınga filtresi ve mağaza ile sterilize Filtresi. Önce 10 U / ml bir final konsantrasyon% 0.9 NaCl normal tuzlu su ile seyreltilmiş kullanabilirsiniz. % 1 jelatin solüsyonu (500 ml) Dulbecco'nun fosfat 500 ml için 5 gr toz jelatin ekleyin tamponlu salin (PBS). 121 ° C'de 30 dakika için otoklavlı. Filtre 0.2 mikron gözenek boyutu vakum filtre ile sterilize edilmiş. % 1 jelatin kaplama çözümü ile Coat 100 mm doku kültürü plakaları Her 100 mm doku kültürü plakası% 1 jelatin solüsyonu 10 ml ekleyin. 37 ° plakaları ° C'de 60 dakika. Kullanmadan önce, jelatin çözüm kaldırmak ve plakalar PBS ile bir kez yıkayın. 2. İnsan Kablosu Kültür Koloni Şekillendirme Endotel Hücreleri (ECFCs) Kan Türetilmiş Bu protokol ECFC dondurulmuş şişeleri, bu deneyde önce laboratuvarda mevcuttur varsayar. ECFC, göbek kordon kanı veya daha önce 7 açıklandığı gibi yetişkin periferik kan ya mononükleer hücre fraksiyonu izole edilebilir . ECFCs Çözülme bir flakon (genellikle 0.5-1×10 6 hücre dondurma medya 1 ml) sıvı azot depolama tankı alınan ve içeriği, 10 ml DMEM orta içeren bir 15 ml konik tüp hemen sulandırmak . 1200 rpm'de 5 dakika boyunca dönerler. Süpernatantı ve 10 ml sıcak EGM-2 orta boy hücre pelletini tekrar süspansiyon haline getirin. Jelatin kaplı 100 mm doku kültürü plakası% 1, ECFC süspansiyon 10 ml ekleyin. 37 ° C ve% 5 CO 2 nemlendirilmiş bir inkübatör plaka koyun. Ertesi gün hafifçe bağlanmamış hücreleri ve orta aspirat ve taze EGM-2 orta boy 10 ml ile bağlı hücreleri beslemek. EGM-2 orta boy ile her 2-3 günde bir plaka besleyin. Hücreleri plaka konfluent hücresel bir tek tabaka ile kaplı olduğu gibi genişletmek için izin ver. Izdiham, aşağıdaki gibi hücreler altkültürü: Aspire kültür ortamı ve hücreleri 10 ml PBS ile yıkayın. PBS çıkarın ve her biri 100 mm plaka için 2 mL tripsin-EDTA çözeltisi ekleyin. Tripsin-EDTA çözeltisi eşit dağıtmak için plakalar yavaşça sallayın. 37 ° ° C'de ve% 5 CO 2 3-5 dakika. Süspansiyon müstakil hücreler yavaşça ters bir mikroskop altında görmek için plaka dokunun. Hücreler tamamen ayırmak, 8 mL EGM-2 orta boy eklemek ve toplamak hücreli çözüm15 ml konik bir tüp içine TION. Bir haemocytometer hücrelerin sayısı ve hasat hücrelerinin toplam sayısını 10 mcL alın. Plaka EGM-2 orta boy kullanılarak, 5.000 hücre / cm ekim yoğunluğu% 1, jelatin kaplı doku kültürü plakalar hücrelerin 2. Inkübatör tabak yerleştirin ve her 2-3 günde bir EGM-2 orta boy ile onları beslemek. Sonraki pasajlar için bu yordamı yineleyin. Hücre popülasyonu genişletilmiş olarak geçiş sayısının takip edin. ECFCs pasajlar 4-8 arasında kullanılacaktır. 3. Kültür İnsan Kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücreler (MKH) Bu protokol, bu deneyde önce laboratuvarda insan MSC dondurulmuş şişeleri mevcuttur varsayar. Kemik iliği gibi daha önce 11 olarak açıklanan aspiratlarda MSC izole edilebilir . MKH Çözülme bir flakon (genellikle 1 ml dondurma medya 0.50-1×10 6 hücre), sıvı azot depolama tankı alınan ve içeriği, 10 ml DMEM orta içeren bir 15 ml konik tüp hemen sulandırmak. 1200 rpm'de 5 dakika boyunca dönerler. Süpernatantı ve 10 ml sıcak MSCGM ortamın hücre pelletini tekrar süspansiyon haline getirin. MSC süspansiyon bir kaplanmamış 100 mm doku kültürü tabak içine 10 ml ekleyin. 37 ° C ve% 5 CO 2 nemlendirilmiş bir inkübatör plaka koyun. Ertesi gün hafifçe bağlanmamış hücreleri ve orta aspirat ve 10 ml taze MSCGM orta ile bağlı hücreleri beslemek. MSCGM ortamı ile her 2-3 günde bir plaka besleyin. Hücreleri plaka konfluent hücresel tek tabaka% 80 ulaştığı gibi genişletmek için izin ver. % 80 izdiham, aşağıdaki gibi hücreler altkültürü: Aspire kültür ortamı ve hücreleri 10 ml PBS ile yıkayın. PBS çıkarın ve her biri 100 mm plaka için 2 mL tripsin-EDTA çözeltisi ekleyin. Tripsin-EDTA çözeltisi eşit dağıtmak için plakalar yavaşça sallayın. 37 ° ° C'de ve% 5 CO2 3-5 dakika. Süspansiyon müstakil hücreler yavaşça ters bir mikroskop altında görmek için plaka dokunun. Hücreler tamamen ayırmak, MSCGM orta 8 mL ve 15 mL konik bir tüp içine hücre çözümü toplamak. Bir haemocytometer hücrelerin sayısı ve hasat hücrelerinin toplam sayısını 10 mcL alın. Plaka kaplanmamış doku kültürü plakaları hücreleri 10.000 hücre / cm 2 MSCGM orta kullanarak bir tohumlama yoğunlukta. Inkübatör tabak yerleştirin ve her 2-3 günde bir MSCGM orta ile onları beslemek. Sonraki pasajlar için bu yordamı yineleyin. Hücre popülasyonu genişletilmiş olarak geçiş sayısının takip edin. MKH pasajlar 4-8 arasında kullanılır. 4. Kollajen / Fibronektin / Fibrinojen Çözüm hücreler tabanda (Gün 0) 0.8×10 6 ECFCs ve 1.2×10 6 MKH her implant ve fare için gerekli olacak; deney öncesinde, kültürün yeterince ECFCs ve MKH olmadığından emin olun. Her kültürün plaka orta aspire hücreler ve 10 ml PBS ile yıkayın. PBS çıkarın ve her biri 100 mm plaka için 2 mL tripsin-EDTA çözeltisi ekleyin. Tripsin-EDTA çözeltisi eşit dağıtmak için plakalar yavaşça sallayın. 3-5 dakika inkübe edin. Süspansiyon müstakil hücreler yavaşça ters bir mikroskop altında görmek için plaka dokunun. Hücreler tamamen ayırmak, DMEM orta 8 mL ve 15 mL konik bir tüp içine hücre çözümü toplamak. Bir haemocytometer hücrelerin sayısı ve ECFCs ve MKH hasat toplam sayısı 10 mcL alın. Transfer 4×10 6 ECFCs (5x 0.8×10 6 hücre) ve tek bir 50 mL konik tüp halinde bir araya 6×10 6 MPCs (5x 1.2×10 6 hücre). Bu beş ayrı implantlar ve fareler için gerekli hücrelerin toplam miktar. 1200 rpm'de santrifüj ve süpernatantı kaldırmak. Yavaşça, kollajen / fibronektin çözüm (3 mg / ml son fibrinojen) 0.9 mL 100 uL Fibrinojen çözüm eklemek; karışımı buz üzerinde tutmak. Buz gibi kolajen / fibronektin / fibrinojen solüsyonu 1 ml hücre pelletini tekrar; kabarcıkları önlemek için hücrelerin karışımı çok nazikçe. 1 ml steril enjektör içine karışımı yerleştirin ve 26-gauge iğne, şırınga ucundaki kapağı ile bir yerde. Enjeksiyona kadar buz üzerinde yüklü şırınga tutun. 5. Immünyetmezligi Nude Fare içine enjeksiyon (Gün 0) Tüm hayvan deneyleri 6 haftalık atimik nude (nu / nu) fareler ile yapılacaktır. Enjeksiyon öncesinde, bir gaz odasına izofluran teslim yerleştirerek bağışık yetmezliği olan farelere uyutmak. (Muayene ile kalp atım monitörü), anestezi ve ayak tutam tepkisiz kadar yaklaşık 2 dakika boyunca farelerin izofluran teneffüs izin verin. Her fare için 50 mcL trombin solüsyonu (10 U / ml), 26-gauge iğne kullanılarak üst dorsal bölge subkutan enjekte edilir. <li> Aynı yerde trombin enjekte edildi, 200 mcL 26-gauge iğne kullanılarak hücre karışımı enjekte edilir. Kollajen jel 37 ° C ve fibrinojen trombin varlığı fibrin jel formu olacak. Sonuç olarak, implant, küçük, ama kayda değer oluşturmalıdır cilt altında tutabilirim. Enjeksiyondan sonra, rahatlık ve sıcaklık için bir katman üzerine gazlı bez farelerin yeri ve ayaktan olana kadar onları gözlemlemek. Sonra sonra, ilk üç gün için günlük farelerin gözlemliyoruz. 6. Hasat (7. Gün) Bir hafta enjeksiyondan sonra fareler, bir gaz odasına sıkıştırılmış CO 2 gaz teslim yerleştirerek euthanize. Bir kez ötenazi, enjeksiyon alanında yakın deri kesilerek açılır ve cerrahi jel fişi çekin. Bir ölçekte alınan jel fişlerinin dijital fotoğraf tavsiye edilir. Hasat jel fişler histolojik kaset içine yerleştirin ve derin onları% 10 nötr gece oda sıcaklığında formalin solüsyonu. Fiksasyon sonra, nötr distile H 2 O ile formalin solüsyonu% 10 yıkayın ve histolojik kasetleri yerde 4 ° C kadar histolojik değerlendirme PBS. 7. Değerlendirme: Histoloji (H & E) ve (hCD31 İmmünohistokimya) Histolojik değerlendirme için, implantlar, parafin ve standart histolojik prosedürlerini kullanarak (7 mikron kalınlığında kesitler) kesitli gömülür. Implantlar orta kesiminde alınan Hematoxilin ve Eosin (H & E) boyanan kesitler değerlendirilmesi ile mikrovasküler dansite sayısal olmalıdır. H & E boyama için standart protokoller başka bir yerde bulunabilir. Mikrodamarlar kırmızı kan hücreleri içeren lumenal yapılar olarak tespit edilebilir. Ortalama sayısı, kırmızı kan hücre dolu damarlarının / mm 2 olarak analiz ve ifade edilen alanlardan mikrodamarlar mikrodamarlar yoğunluğu Raporu . Mikrovasküler gemileri, alınan implant bölümleri insan doğası immünohistokimyasal göstermek için özel bir insan CD31 (hCD31) standart boyama protokollerini kullanarak antikor ile boyanmış olmalıdır. 1:100 dilüsyon; DakoCytomation (kedi # M0823 Clone JC70A) monoklonal fare anti-insan CD31 antikoru kullanmanızı öneririz. Bu antikor insan özgüllük paralel 7,11 boyandı fare doku kesitlerinde bir çeşitlilik ile elde edilen negatif reaksiyon tarafından teyit edilmiştir. Notu, fare kan damarları genellikle (özellikle sınır civarında) implantlar içinde görülür, ancak fare gemiler, bu antikor ile pozitif leke yapmaz. Buna ek olarak, CD90 veya α-düz kas aktin (α-SMA) karşı insan-spesifik antikorların varlığı insan MSC ile immünohistokimyasal boyama ile tespit edilebilir. İnsan MSC, yeni oluşan kan damarlarının perivasküler bölgede ve interstisyel implant 11 boyunca bulunan iki bulunur . 8. Temsilcisi Sonuçlar Şekil 1. ECFC ve MSC kültürlerinin Tipik bir görünüm . Faz kontrast mikrograflar kültür ECFCs ve MKH tipik bir görünüm gösterir. (A) endotel hücreleri karakteristik parke taşı morfolojisi gösteren kordon kanı türevi ECFCs konfluent tek tabaka. (B) İnsan kemik iliği MKH bir mil şekli morfolojisi gösteren türetilmiştir. Ölçekleyici barlar, 200 um. Şekil 2. 7 gün eksplante fişlerinin Görünüm. İnsan kordon kanı türevi iliği kaynaklı MKH ECFCs ve kemik kollajen / fibronektin / fibrin jel gömülü ve metinde açıklandığı gibi çıplak farelere subkutan implante edildi. (A) 7 gün sonra, fare ötenazi edildikten sonra cilt enjeksiyon alanı yakınında açmak, kesmek ve cilt saygısız hücre / jel fiş maruz. (B) fişi Görünüm fare ve formalin fiksasyonu önce ameliyatla çıkarıldı. Implantın kırmızı renk vaskülarizasyonun bir göstergesidir. Şekil 3. Eksplante fişler vasküler ağ histolojik tanımlama. Eksplante fişlerinin orta kesiminde alınan Hematoxilin ve Eosin (H & E) boyanan kesitler. (A) çevreleyen ana dokuların bağlamda (yani, yağ dokusu ve iskelet kası) implant (sarı kesikli çizgi ile işaretlenmiş) Düşük büyütme (10x) mikrografı. (B) Yüksek büyütme (40x) mikrografı fişi içinde görüntüleyerek birden fazla mikrodamarlar (sarı ok ucu bazıları işaret); mikrodamarlar kırmızı kan hücreleri içeren lumenal yapılar olarak tespit edilebilir. Şekil 4. Insan İmmünohistokimyasal kimlikeksplante fişler orta kısmından lümen. İmmünohistokimyasal boyanan kesitler alınmıştır. 1:100 dilüsyon; Boyama DakoCytomation (kedi # M0823 Clone JC70A); bir monoklonal fare anti-insan CD31 (hCD31) antikoru kullanılarak gerçekleştirilen hücre çekirdekleri hematoxilin ile zıt. (A) konak dokuları çevreleyen bağlamında implant (siyah bir kesik çizgi ile tasvir) Düşük büyütme (10x) mikrografı. İnsan özgü, CD31 pozitif mikrodamarlar kahverengi lekeli (peroksidaz boyama). (B) Yüksek büyütme (40x) mikrografı fişi içinde birden fazla insan mikrodamarlar (siyah ok ucu bazı hCD31 olumlu lümen işaret).