Bioingegneria reti umane in topi immunodeficienti microvascolari

1. Preparazione Fai EGM-2 di media (500 ml) Aggiungere 100 ml di siero fetale bovino (FBS) a 395 mL di endoteliale medio basale (EBM-2). Aggiungere 5 ml di 100x Glutamina-penicillina-streptomicina soluzione (GPS). Aggiungere tutti gli EGM-2 supplementi SingleQuots ad eccezione di idrocortisone (cioè, VEGF, hFGF-B, R-IGF-1, hEGF, eparina, acido ascorbico, e GA-1000). Filtro sterilizzato con un 0,2 micron filtro vuoto dimensioni dei pori. Fai la media MSCGM (500 ml) Aggiungere 5 ml di GPS 100x a 440 ml di mesenchimali medio basale delle cellule staminali (MSCBM). Aggiungere tutto il contenuto del kit MSCGM SingleQuots. Aggiungi hFGF-B aliquota da EGM-2 supplementi SingleQuots. Filtro sterilizzato con un 0,2 micron filtro vuoto dimensioni dei pori. Fai DMEM media (500 ml) Aggiungere 50 ml di siero fetale bovino (FBS) a 440 ml di glucosio 1x alta Dulbecco modificato (DMEM). Aggiungere 5 ml di GPS 100x. Aggiungere 5 ml di soluzione di aminoacidi non essenziali. Filtro sterilizzato con un 0,2 micron filtro vuoto dimensioni dei pori. Fai collagene / fibronectina soluzione (3,6 ml; fatta lo stesso giorno di iniezione) Aggiungere 0,4 ml di DMEM 10x a 150 ml di distillato H 2 O. Aggiungere 100 ml di HEPES 1M (25 mM finale). Accuratamente, aggiungere 2,4 ml di collagene bovino (5 mg / ml magazzino; 3 mg / ml finale) e mescolare delicatamente sul ghiaccio. Regolare il pH neutro con l'aggiunta di 1N NaOH (circa 30 mL). Usa indicatore rosso fenolo per valutare pH neutro; alternativa, utilizzare la carta di prova per il monitoraggio del pH pH. Aggiungere 120 ml di fibronectina umana (1 mg / ml di brodo, 30 mg / ml finale) Aggiungere 0,4 ml di FBS (10% finale) mantenere soluzione in ghiaccio fino al momento dell'uso. Preparare la soluzione di fibrinogeno (1 ml; fatta lo stesso giorno di iniezione) Aggiungere 30 mg di fibrinogeno in polvere per 1 ml di NaCl 0.9N (pH 7,4) soluzione (30 mg / ml finale). Prima dell'uso, incubare la soluzione fibrinogeno a 37 ° C per 30 minuti. Mescolare delicatamente, senza vortex, prima della sua Oltre al collagene / fibronectina gel. Preparare la soluzione di trombina (200 ml) Aggiungere 1 KU della trombina in polvere a 200 ml di soluzione salina allo 0.9% NaCl normale (50 U / mL). Filtro sterilizzato con un 0,2 micron filtro pori siringa dimensioni e conservare a -20 ° C fino al momento dell'uso. Prima dell'uso, diluire con soluzione fisiologica 0,9% NaCl normale ad una concentrazione finale di 10 U / mL. Fare 1% di soluzione di gelatina (500 ml) Aggiungere 5 g di gelatina in polvere per 500 ml di fosfato di soluzione salina tamponata Dulbecco (PBS). Sterilizzati in autoclave a 121 ° C per 30 min. Filtro sterilizzato con un 0,2 micron filtro vuoto dimensioni dei pori. Cappotto da 100 mm piastre di coltura di tessuto con 1% di soluzione di rivestimento di gelatina Aggiungere 10 ml di soluzione all'1% di gelatina per ogni 100 mm piastra di coltura. Incubare le piastre a 37 ° C per 60 min. Prima dell'uso, rimuovere la soluzione di gelatina e lavare i piatti una volta con PBS. 2. Cultura del cordone ombelicale umano derivati ​​dal sangue umano endoteliali che formano colonie Cells (ECFCs) Questo protocollo si assume fiale congelate ECFC sono disponibili nel laboratorio prima di questo esperimento. ECFC può essere isolata dalla frazione di cellule mononucleate del sangue sia del cordone ombelicale o adulte del sangue periferico come descritto in precedenza 7. Scongelare un flaconcino di ECFCs (tipicamente 0.5-1×10 6 cellule in 1 ml di mezzi di congelamento) prelevata dal serbatoio di stoccaggio di azoto liquido e subito diluirne il contenuto in un tubo da 15 ml conica contenente 10 ml di terreno DMEM. Rotazione a 1200 rpm per 5 min. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 10 ml di caldo EGM-2 di media. Aggiungere i 10 ml di sospensione ECFC in un 1% di gelatina rivestite da 100 mm piastra di coltura dei tessuti. Porre la piastra in un incubatore umidificato a 37 ° C e 5% di CO 2. Il giorno dopo, aspirato delicatamente le cellule non legato e medie imprese, e dei mangimi legati cellule con 10 ml di fresca EGM-2 di media. Alimentare la piastra ogni 2-3 giorni con EGM-2 di media. Consentono alle cellule di espandere in modo che la piastra è coperta da un monostrato confluenti cellulare. Alla confluenza, le cellule sottocultura come segue: Aspirare il terreno di coltura e lavare le cellule con 10 ml di PBS. Rimuovere PBS e aggiungere 2 ml di tripsina-EDTA soluzione per ogni 100 mm piatto. Agitare delicatamente le piastre per distribuire uniformemente la tripsina-EDTA soluzione. Incubare a 37 ° C e 5% di CO 2 per 3-5 minuti. Battere delicatamente la piastra per vedere le cellule in sospensione staccato sotto un microscopio invertito. Quando le cellule staccare completamente, aggiungere 8 mL di EGM-2 medie e raccogliere la soluzione delle cellulezione in un tubo da 15 ml conica. Prendere 10 L per contare le cellule in una emocitometro ed elaborare il numero totale delle cellule raccolte. Piastra le cellule in piastre di tessuto 1% di gelatina rivestita di coltura ad una densità di semina di 5.000 cellule / cm 2 utilizzando EGM-2 di media. Posizionare le piastre in incubatrice e dar loro da mangiare ogni 2-3 giorni con EGM-2 di media. Ripetere questa procedura per i passaggi successivi. Tenere traccia del numero di passaggio come la popolazione di cellule è espanso. ECFCs saranno utilizzati tra passaggi 4-8. 3. Cultura di ossa umane derivate dal midollo cellule staminali mesenchimali (MSCs) Questo protocollo si assume fiale congelati di MSC umane sono disponibili nel laboratorio prima di questo esperimento. MSC possono essere isolate dal midollo osseo aspirati come descritto in precedenza 11. Scongelare un flaconcino di cellule staminali mesenchimali (tipicamente 0.50-1×10 6 cellule in 1 ml di mezzi di congelamento) prelevata dal serbatoio di stoccaggio di azoto liquido e subito diluirne il contenuto in un tubo da 15 ml conica contenente 10 ml di terreno DMEM. Rotazione a 1200 rpm per 5 min. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 10 ml di medium MSCGM caldo. Aggiungere i 10 ml di sospensione MSC in una patinata da 100 mm piastra di coltura. Porre la piastra in un incubatore umidificato a 37 ° C e 5% di CO 2. Il giorno dopo, aspirato delicatamente le cellule non legato e medie imprese, e dei mangimi legati cellule con 10 ml di medium MSCGM fresca. Alimentare la piastra ogni 2-3 giorni con media MSCGM. Consentono alle cellule di espandere in modo che la piastra raggiunge l'80% dei confluenti monostrato cellulare. Al 80% confluenza, le cellule sottocultura come segue: Aspirare il terreno di coltura e lavare le cellule con 10 ml di PBS. Rimuovere PBS e aggiungere 2 ml di tripsina-EDTA soluzione per ogni 100 mm piatto. Agitare delicatamente le piastre per distribuire uniformemente la tripsina-EDTA soluzione. Incubare a 37 ° C e 5% di CO2 per 3-5 minuti. Battere delicatamente la piastra per vedere le cellule in sospensione staccato sotto un microscopio invertito. Quando le cellule staccare completamente, aggiungere 8 ml di terreno MSCGM e raccogliere la soluzione in una cella da 15 ml tubo conico. Prendere 10 L per contare le cellule in una emocitometro ed elaborare il numero totale delle cellule raccolte. Piastra le cellule dei tessuti non rivestiti in lastre di coltura ad una densità di semina di 10.000 cellule / cm 2 utilizzando medium MSCGM. Posizionare le piastre in incubatrice e dar loro da mangiare ogni 2-3 giorni con media MSCGM. Ripetere questa procedura per i passaggi successivi. Tenere traccia del numero di passaggio come la popolazione di cellule è espanso. MSC saranno utilizzati tra passaggi 4-8. 4. Risospensione delle celle di collagene / fibronectina / Fibrinogen Solution (giorno 0) Prima dell'esperimento, assicurarsi che non vi sono abbastanza ECFCs e MSC nella cultura; 6 ECFCs 0.8×10 e 1.2×10 MSC 6 sarà richiesto per ogni impianto e mouse. Aspirare il mezzo di ogni piastra di coltura e lavare le cellule con 10 ml di PBS. Rimuovere PBS e aggiungere 2 ml di tripsina-EDTA soluzione per ogni 100 mm piatto. Agitare delicatamente le piastre per distribuire uniformemente la tripsina-EDTA soluzione. Incubare per 3-5 minuti. Battere delicatamente la piastra per vedere le cellule in sospensione staccato sotto un microscopio invertito. Quando le cellule staccare completamente, aggiungere 8 ml di terreno DMEM e raccogliere la soluzione in una cella da 15 ml tubo conico. Prendere 10 L per contare le cellule in una emocitometro ed elaborare il numero totale di ECFCs e MSC raccolto. Trasferimento 4×10 6 ECFCs (5x 0.8×10 6 celle) e 6×10 6 PPM (5x 1.2×10 6 celle) insieme in un unico tubo da 50 ml conica. Questa è la quantità totale di cellule necessario per cinque impianti singoli e topi. Centrifugare a 1200 rpm e rimuovere il surnatante. Delicatamente, aggiungere 100 uL di soluzione Fibrinogen a 0,9 ml di collagene / fibronectina soluzione (3 mg / ml concentrazione di fibrinogeno finale); mantenere la miscela in ghiaccio. Risospendere il pellet cellulare in 1 ml di ghiaccio freddo collagene / fibronectina / fibrinogeno soluzione; mescolare le cellule molto delicatamente per evitare bolle. Caricare il composto in una 1-ml siringa sterile, e piazzare una 26-gauge con il suo cappello sulla punta della siringa. Tenere la siringa caricata sul ghiaccio fino ad iniezione. 5. L'iniezione in mouse immunodeficienti Nude (giorno 0) Tutti gli esperimenti sugli animali saranno effettuate con 6 settimane di età atimici nudi (nu / nu) topi. Prima della iniezione, anestetizzare i topi immunodeficienti mettendoli in una camera a gas offrendo isoflurano. Lasciare i topi di inalare il isoflurano per circa 2 minuti fino a quando sono anestetizzati e non risponde a pizzico tep (monitorare il loro cuore batte per l'ispezione). Per ogni mouse, iniettare 50 ml di soluzione di trombina (10 U / mL) per via sottocutanea nella regione dorsale superiore utilizzando una 26-gauge. <li> Nello stesso luogo dove è stato iniettato trombina, iniettare 200 ul della miscela di cellule utilizzando un 26-gauge. Collagene gel a 37 ° C e fibrinogeno gel di fibrina si forma in presenza di trombina. Di conseguenza, l'impianto dovrebbe formare un piccolo, ma apprezzabile, bump sotto la pelle. Dopo l'iniezione, posizionare il mouse su uno strato di garza per il comfort e calore e osservarle fino a diventare ambulatoriale. Poi, dopo, osservare i topi giorno per i primi tre giorni. 6. La raccolta (Giorno 7) Una settimana dopo le iniezioni, eutanasia i topi mettendoli in una camera a gas compresso fornire gas CO 2. Una volta eutanasia, aprì la pelle vicino alla zona di iniezione e rimuovere chirurgicamente la spina gel. Fotografie digitali dei tappi gel recuperato con una scala si consiglia. Posizionare i tappi di gel raccolte in cassette istologiche e profondo li in 10% formalina tamponata neutra durante la notte a temperatura ambiente. Dopo la fissazione, lavare il 10% di formalina tamponata neutra via con acqua distillata H 2 O e posto le cassette istologiche a 4 ° C in PBS fino valutazione istologica. 7. Valutazione: Istologia (H & E) e immunoistochimica (hCD31) Per la valutazione istologica, gli impianti sono inclusi in paraffina e sezionati (7 micron di spessore sezioni) utilizzando le normali procedure istologiche. Quantificare la densità dei microvasi dalla valutazione di Hematoxilin e eosina (H & E) sezioni colorate tratto da la parte centrale degli impianti. Protocolli standard per la colorazione H & E può essere trovato altrove. Microvasi possono essere identificati come strutture luminale contenenti globuli rossi. Segnala densità microvasi come il numero medio di sangue di globuli rossi pieni di microvasi dai campi analizzati e espressa come navi / mm 2. Per dimostrare la natura umana dei vasi microvascolare, le sezioni della protesi devono essere recuperate immunoistochimiche colorate con un essere umano specifico per CD31 (hCD31) anticorpi utilizzando protocolli standard di colorazione. Si consiglia di utilizzare il topo monoclonale anti-CD31 umano da anticorpi DakoCytomation (Clone JC70A;. Cat # M0823) ad una diluizione 1:100. La specificità umana di questo anticorpo è stata confermata dalla reazione negativa ottenuta con una varietà di sezioni di tessuto mouse che sono stati colorati in parallelo 7,11. Di nota, i vasi sanguigni del mouse si vedono spesso all'interno degli impianti (in particolare intorno al confine), ma vasi del mouse non si macchia positiva con questo anticorpo. Inoltre, la presenza di MSC umane possono essere rilevati attraverso prova immunoistochimica con anticorpi specifici anti-umano contro CD90 o α-actina del muscolo liscio (α-SMA). MSC umane si trovano sia nella regione perivascolare di recente formazione dei vasi sanguigni e interstizialmente situati in tutto l'impianto 11. 8. Rappresentante Risultati Figura 1. Aspetto tipico di ECFC e culture MSC. Microscopio contrasto di fase visualizzare il tipico aspetto del ECFCs e MSC in coltura. (A) monostrato confluenti di sangue del cordone derivati ​​ECFCs visualizzare la caratteristica acciottolata, morfologia delle cellule endoteliali. (B) L'osso umano cellule staminali mesenchimali derivate dal midollo visualizzazione di una morfologia forma mandrino. Scaler bar, 200 um. Figura 2. Aspetto di spine espiantati al giorno 7. Derivati ​​dal sangue umano ECFCs midollo osseo e cellule staminali mesenchimali derivate dal midollo sono stati incorporati in collagene / fibronectina / gel di fibrina e impiantato sottocute in topi nudi, come descritto nel testo. (A) Dopo 7 giorni, una volta che il mouse è stato l'eutanasia, aprì la pelle vicino alla zona di iniezione ed esporre la cellula / gel spina girando la pelle. (B) Aspetto della spina rimossi chirurgicamente dal mouse e prima della fissazione in formalina. Il colore rosso della protesi è indice di vascolarizzazione. Figura 3. Identificazione istologica di rete vascolare in spine espiantati. Hematoxilin e eosina (H & E) sezioni colorate tratto dalla parte centrale dei tappi espiantati. (A) a basso ingrandimento (10x) Micrografia visualizzare l'impianto (segnato da una linea gialla tratteggiata) nel contesto di tessuti dell'ospite circostanti (ad esempio, il tessuto adiposo e muscolo scheletrico). (B) Alto ingrandimento (40x) Micrografia visualizzazione microvasi multipli (freccia gialla che punta ad alcuni di loro) all'interno del tappo; microvasi possono essere identificati come strutture luminale contenenti globuli rossi. Figura 4. Identificazione immunoistochimica di umanolumen. immunoistochimiche sezioni colorate tratto dalla parte centrale dei tappi espiantati. La colorazione è stata effettuata utilizzando un mouse anticorpo monoclonale anti-CD31 umano (hCD31) da anticorpi DakoCytomation (Clone JC70A;. Cat # M0823) ad una diluizione 1:100; nuclei cellulari erano di contrasto con hematoxilin. (A) a basso ingrandimento (10x) Micrografia visualizzare l'impianto (delineato da una linea nera tratteggiata) nel contesto di tessuti circostanti ospitante. Umano specifico, CD31-positive microvasi sono macchiati di marrone (colorazione con perossidasi). (B) Alta ingrandimento (40x) Micrografia la visualizzazione di più umano microvasi (nero punta di freccia che punta ad un certo hCD31-positivi lumen) all'interno della spina.