الهندسة الحيوية شبكات الاوعية الدموية الدقيقة الإنسان في الفئران العوز المناعي
Summary
هنا ، نحن تصف منهجية لإيصال الدم الحبل الإنسان المستمدة من البطانية مستعمرة تشكيل الخلايا (ECFCs) ونخاع العظم المشتقة من الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCS) ، جزءا لا يتجزأ من هلام الكولاجين / فبرونيكتين ، تحت الجلد في الفئران العوز المناعي. هذا المزيج خلية / هلام بإنشاء شبكة الأوعية الدموية التي تربط الإنسان مع الأوعية الدموية الماوس.
Abstract
فإن مستقبل هندسة الأنسجة والخلايا المستندة إلى علاجات لتجديد الأنسجة تعتمد على الأرجح على قدرتنا على توليد شبكات الأوعية الدموية وظيفية في الجسم الحي. في هذا الصدد ، والبحث عن نماذج تجريبية لبناء شبكات الأوعية الدموية في الجسم الحي هو في غاية الأهمية 1. وكان عرض لأول مرة في جدوى شبكات الاوعية الدموية الدقيقة الهندسة الحيوية في الجسم الحي باستخدام الأنسجة البشرية المستمدة من الخلايا البطانية ناضجة (ECS) 2-4 ، ولكن هذه الخلايا البطانية ذاتي المشاكل الحالية للاستخدام السريري واسعة ، لأنها من الصعب الحصول على كميات كافية وتتطلب حصاد من الأوعية الدموية الموجودة. هذه القيود قد حرض على البحث عن مصادر أخرى للECS. تحديد الخلايا التي تشكل بطانة الأوعية الدموية مستعمرة (ECFCs) في الدم قدمت فرصة لغير جراحية الحصول ECS 5-7. لقد أظهرنا والمؤلفين الأخرى التي ECFCs الدم المستمدة من البالغين والحبل لديها القدرة على تشكيل شبكات الأوعية الدموية في الجسم الحي وظيفية 7-11. الأهم من ذلك ، وقد أظهرت هذه الدراسات أيضا أن الحصول على شبكات الأوعية الدموية مستقرة ودائمة ، ECFCs تتطلب التعاون مع زرع الخلايا المحيطة بالأوعية. في مقايسة وصفنا هنا يوضح هذا المفهوم : كيف نظهر الإنسان المستمدة من دم الحبل السري ECFCs يمكن دمجها مع نخاع العظام المستمدة من الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCS) على النحو تعليق خلية واحدة في هلام الكولاجين / فبرونيكتين / الفيزيولوجية لتشكيل الإنسان وظيفية شبكة الأوعية الدموية في غضون 7 أيام بعد زرع في ماوس العوز المناعي. ويمكن ملاحظة وجود شمعة ECFC مبطنة البشرية التي تحتوي على الكريات الحمراء المضيفة في جميع أنحاء يزرع يشير ليس فقط على تشكيل (دي نوفو) من شبكة الأوعية الدموية ، ولكن أيضا على تطوير anastomoses الفنية مع استضافة الدورة الدموية. هي مناسبة بشكل مثالي لهذا النموذج الفأري شبكة الأوعية الدموية البشرية الهندسة البيولوجية لإجراء دراسات عن الآليات الخلوية والجزيئية لتشكيل شبكة الأوعية الدموية البشرية وتطوير استراتيجيات ليوعي الأنسجة هندسيا.
Protocol
1. إعداد جعل EGM – 2 متوسطة (500 مليلتر) إضافة 100 مل من مصل بقري جنيني (FBS) إلى 395 مل من بصل متوسطة غشائي (EBM – 2). إضافة 5 مل من محلول الجلوتامين – البنسلين الستربتوميسين 100X (GPS). إضافة كافة EGM – 2 SingleQuots ملاحق باستثناء هيدروكورتيزون (أي VEGF ، hFGF – B ، R – IGF – 1 ، hEGF ، الهيبارين ، وحامض الأسكوربيك ، وGA – 1000). تصفية تعقيمها مع 0.2 ميكرومتر حجم المسام تصفية فراغ. جعل MSCGM المتوسطة (500 مليلتر) إضافة 5 مل من GPS 100X إلى 440 مل من الخلايا الجذعية الوسيطة بصل متوسطة (MSCBM). إضافة كافة محتويات عدة SingleQuots MSCGM. إضافة hFGF – B قسامة من مكملات SingleQuots EGM – 2. تصفية تعقيمها مع 0.2 ميكرومتر حجم المسام تصفية فراغ. جعل DMEM المتوسطة (500 مليلتر) إضافة 50 مل من مصل بقري جنيني (FBS) إلى 440 مل من ارتفاع السكر في 1X Dulbecco في متوسطة النسر التعديل (DMEM). إضافة 5 مل من GPS 100X. إضافة 5 مل من محلول حمض أميني غير الأساسية. تصفية تعقيمها مع 0.2 ميكرومتر حجم المسام تصفية فراغ. جعل الكولاجين / فبرونيكتين حل (3.6 مل ؛ اليوم نفسه مصنوع من الحقن) إضافة 0.4 مل من DMEM 10X إلى 150 ميكرولتر من المقطر O. 2 H إضافة 100 ميكرولتر من HEPES 1M (25 ملي النهائي). بعناية ، وإضافة 2.4 مل من الكولاجين البقري (5 ملغ / مل الأسهم ، 3 ملغ / مل النهائي) ومزيج بلطف على الجليد. ضبط الرقم الهيدروجيني لمحايد بإضافة 1N هيدروكسيد الصوديوم الحل (حوالي 30 ميكرولتر). استخدام مؤشر أحمر الفينول لتقييم محايد الرقم الهيدروجيني ؛ بديلة ، استخدم ورقة اختبار درجة الحموضة لمراقبة درجة الحموضة. إضافة 120 ميكرولتر من فبرونيكتين الإنسان (1 ملغ / مل الأسهم و 30 ميكروغرام / مل النهائي) إضافة 0.4 مل من FBS (10 ٪ النهائي) يبقي الحل على الجليد حتى الاستخدام. جعل حل الفيبرينوجين (1 مل ؛ اليوم نفسه مصنوع من الحقن) إضافة 30 ملغم من مسحوق الفيبرينوجين إلى 1 مل من كلوريد الصوديوم 0.9N (الرقم الهيدروجيني 7.4) حل (30 ملغ / مل النهائي). قبل الاستخدام ، احتضان الحل الفيبرينوجين في 37 لمدة 30 دقائق درجة مئوية. المزيج بلطف ، دون vortexing ، قبل بالإضافة إلى الجل الكولاجين / فبرونيكتين. جعل ثرومبين حل (200 مليلتر) إضافة 1 KU من ثرومبين المجفف إلى 200 مليلتر من المياه المالحة كلوريد الصوديوم 0.9 ٪ العادية (50 يو / مل). تصفية تعقيمها مع 0.2 ميكرومتر حجم المسام تصفية حقنة وتخزينها في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام. قبل الاستخدام ، مع تخفيف ملوحة كلوريد الصوديوم 0.9 ٪ طبيعية لتركيز النهائي من 10 يو / مليلتر. جعل حل الجيلاتين 1 ٪ (500 مليلتر) إضافة مخزنة 5 غرام من مسحوق الجيلاتين إلى 500 مل من الفوسفات Dulbecco في المياه المالحة (PBS). تعقيمها في درجة حرارة 121 مئوية لمدة 30 دقيقة. تصفية تعقيمها مع 0.2 ميكرومتر حجم المسام تصفية فراغ. معطف زراعة الأنسجة لوحات 100 ملم مع 1 ٪ من محلول طلاء الجيلاتين إضافة 10 مل من محلول الجيلاتين 1 ٪ الى كل لوحة نسيج الثقافة 100 ملم. احتضان لوحات في 37 دقيقة لمدة 60 درجة مئوية. قبل استعمالها ، وإزالة حل الجيلاتين وتغسل الصحون مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني. 2. ثقافة الإنسان الحبل الدم المشتقة غشائي الخلايا المكونة للمستعمرة (ECFCs) هذا البروتوكول يفترض قارورة المجمدة للECFC تتوفر في المختبر قبل هذه التجربة. يمكن عزل ECFC من جزء الخلية وحيدة النواة إما دم الحبل السري أو الدم المحيطي الكبار كما هو موضح سابقا 7. أذاب one قنينة من ECFCs (عادة 0.5 – 1×10 6 الخلايا في 1 مل من وسائل الإعلام التجميد) مأخوذ من خزان النتروجين السائل والتخزين تمييع مضمونها على الفور في أنبوب 15 مل مخروطي يحتوي على 10 مل من DMEM المتوسطة. تدور في 1200 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق. وطاف إزالة resuspend الكرية خلية في 10 مل من المتوسط EGM – 2 الدافئة. إضافة 10 مل من تعليق ECFC إلى ٪ 1 واحد الجيلاتين المغلفة زراعة الأنسجة 100 ملم لوحة. وضع لوحة في حاضنة ترطيب عند 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO 2. اليوم التالي ، ونضح برفق خارج الخلايا غير منضم والمتوسطة ، وتغذية الخلايا ملزمة مع 10 مل من المتوسط EGM – 2 الطازجة. خدمة لوحة كل 2-3 أيام مع EGM – 2 المتوسط. السماح لتوسيع الخلايا بحيث يتم تغطية لوحة من قبل أحادي الطبقة الخلوية متموجة. في نقطة التقاء ، ثقافة فرعية الخلايا على النحو التالي : نضح بها على المديين المتوسط والثقافة ، وغسل الخلايا مع 10 مل من برنامج تلفزيوني. إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة 2 مل من EDTA – التربسين حل كل لوحة 100 ملم. صخرة بلطف لوحات توزيع بالتساوي الحل التربسين – EDTA. احتضان عند 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO 2 لمدة 3-5 دقائق. اضغط برفق لوحة لرؤية خلايا منفصلة في تعليق تحت مجهر مقلوب. عندما فصل الخلايا تماما ، إضافة 8 مل من EGM – 2 المتوسط وجمع المحاليل الخليةنشوئها في أنبوب 15 مل المخروطية. يستغرق 10 ميكرولتر لحساب الخلايا في haemocytometer والعمل على العدد الكلي للخلايا المقطوع. لوحة الخلايا في 1 ٪ الجيلاتين المغلفة لوحات زراعة الأنسجة في مناطق ذات كثافة البذر من 5000 خلية / سم 2 باستخدام EGM – 2 المتوسط. وضع لوحات في الحاضنة وإطعامهم كل 2-3 أيام مع EGM – 2 المتوسط. كرر هذا الإجراء المقاطع اللاحقة. تعقب عدد مرور كما هو توسيع السكان الخلية. وسوف تستخدم ECFCs بين الممرات 4-8. 3. ثقافة نخاع العظام البشرية المستمدة من الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCS) هذا البروتوكول يفترض قوارير للجنة السلامة البحرية المجمدة البشرية المتوفرة في المختبر قبل هذه التجربة. يمكن عزل MSC من نخاع العظم aspirates كما هو موضح سابقا 11. أذاب one قنينة من اللجان الدائمة (عادة 0.50 – 1×10 6 خلايا في وسائل الإعلام 1 مل التجميد) مأخوذ من خزان النتروجين السائل والتخزين تمييع مضمونها على الفور في أنبوب 15 مل مخروطي يحتوي على 10 مل من DMEM المتوسطة. تدور في 1200 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق. وطاف إزالة resuspend الكرية خلية في 10 مل من المتوسط MSCGM الدافئة. إضافة 10 مل من تعليق لجنة السلامة البحرية في واحدة غير المصقول 100 ملم أنسجة لوحة الثقافة. وضع لوحة في حاضنة ترطيب عند 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO 2. اليوم التالي ، ونضح برفق خارج الخلايا غير منضم والمتوسطة ، وتغذية الخلايا ملزمة مع 10 مل من المتوسط MSCGM الطازجة. خدمة لوحة كل 2-3 أيام مع MSCGM المتوسطة. يسمح للخلايا لتوسيع مثل هذه اللوحة تصل الى 80 ٪ من أحادي الطبقة الخلوية متموجة. التقاء في 80 ٪ ، ثقافة فرعية الخلايا على النحو التالي : نضح بها على المديين المتوسط والثقافة ، وغسل الخلايا مع 10 مل من برنامج تلفزيوني. إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة 2 مل من EDTA – التربسين حل كل لوحة 100 ملم. صخرة بلطف لوحات توزيع بالتساوي الحل التربسين – EDTA. احتضان عند 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO2 لمدة 3-5 دقائق. اضغط برفق لوحة لرؤية خلايا منفصلة في تعليق تحت مجهر مقلوب. عندما فصل الخلايا تماما ، إضافة 8 مل من المتوسط MSCGM وجمع حل الخلية في أنبوب 15 مل المخروطية. يستغرق 10 ميكرولتر لحساب الخلايا في haemocytometer والعمل على العدد الكلي للخلايا المقطوع. لوحة الخلايا غير المصقول في لوحات زراعة الأنسجة في مناطق ذات كثافة البذر من 10000 خلية / سم 2 باستخدام MSCGM المتوسطة. وضع لوحات في الحاضنة وإطعامهم كل 2-3 أيام مع MSCGM المتوسطة. كرر هذا الإجراء المقاطع اللاحقة. تعقب عدد مرور كما هو توسيع السكان الخلية. وستستخدم اللجان الدائمة بين الممرات 4-8. 4. إعادة تعليق من خلايا الكولاجين في / [فيبرونكتين] / الفيبرينوجين محلول (يوم 0) قبل هذه التجربة ، تأكد من وجود ما يكفي من ECFCs واللجان الدائمة في الثقافة ، وسوف تكون هناك حاجة 0.8×10 6 ECFCs واللجان الدائمة 1.2×10 6 لكل زرع والفأرة. نضح من المتوسط من كل لوحة والثقافة ، وغسل الخلايا مع 10 مل من برنامج تلفزيوني. إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة 2 مل من EDTA – التربسين حل كل لوحة 100 ملم. صخرة بلطف لوحات توزيع بالتساوي الحل التربسين – EDTA. احتضان لمدة 3-5 دقائق. اضغط برفق لوحة لرؤية خلايا منفصلة في تعليق تحت مجهر مقلوب. عندما فصل الخلايا تماما ، إضافة 8 مل من المتوسط DMEM وجمع حل الخلية في أنبوب 15 مل المخروطية. يستغرق 10 ميكرولتر لحساب الخلايا في haemocytometer والعمل على العدد الإجمالي للECFCs وتحصد MSCS. نقل 4×10 6 ECFCs (5X 0.8×10 6 خلايا) والبلدان المتوسطية الشريكة 6×10 6 (5X 1.2×10 6 خلايا) معا في أنبوب 50 مل واحد المخروطية. هذا هو المبلغ الاجمالي المطلوب من الخلايا لمدة خمس يزرع الفردية والفئران. أجهزة الطرد المركزي في 1200 دورة في الدقيقة وإزالة طاف. بلطف ، وإضافة 100 UL حل الفيبرينوجين إلى 0.9 مل من الكولاجين / فبرونيكتين الحل (3 ملغ / مل تركيز الفيبرينوجين النهائي) ؛ حفاظ على الخليط على الجليد. Resuspend بيليه في الخلية في 1 مل من محلول الجليد الكولاجين / فبرونيكتين / الفيبرينوجين الباردة ؛ خليط الخلايا بلطف شديد لتجنب الفقاعات. تحميل الخليط في المحاقن المعقمة 1 مل ، ومكان إبرة عيار 26 مع غطاء لها على طرف الحقنة. الحفاظ على حقنة تحميلها على الثلج حتى الحقن. 5. حقن الفأر عاري العوز المناعي (يوم 0) وسيتم تنفيذ جميع التجارب على الحيوانات خارجا مع 6 أسابيع عارية athymic القديمة (نو / نو) الفئران. قبل الحقن ، وتخدير الفئران العوز المناعي عن طريق وضعها في غرفة الغاز تسليم isoflurane. السماح للفئران ليستنشق isoflurane لحوالي 2 دقيقة حتى يتم تخدير وتستجيب لقرصة إصبع القدم (مراقبة دقات قلوبهم عن طريق التفتيش). لكل الماوس ، وضخ 50 ميكرولتر من محلول ثرومبين (10 يو / مل) تحت الجلد في المنطقة الظهرية العليا باستخدام إبرة عيار 26. <li> وفي نفس المكان الذي تم حقنه ثرومبين ، وضخ 200 ميكرولتر من خليط الخلايا باستخدام إبرة عيار 26. سوف الكولاجين هلام في 37 درجة مئوية والفيبرينوجين ستشكل الليفين هلام في حضور ثرومبين. نتيجة لذلك ، ينبغي أن زرع تشكيل صغيرة ، ولكن ملموس ، نتوء تحت الجلد. بعد الحقن ، ووضع الفئران على طبقة من الشاش لتوفير الراحة والدفء ومراعاتها حتى تصبح المتنقلة. ثم بعد ، ومراقبة الفئران يوميا في الأيام الثلاثة الأولى. 6. حصاد (يوم 7) بعد أسبوع من الحقن ، والموت ببطء في الفئران عن طريق وضعها في غرفة الغاز المضغوط ايصال الغاز CO 2. الموت الرحيم مرة واحدة ، وقطع الجلد مفتوحة بالقرب من منطقة الحقن وإزالة جراحيا المكونات هلام. وينصح الصور الرقمية من المقابس هلام استرجاع مع مقياس. ضع سدادات هلام تحصد في الكاسيت النسيجية وعميقة جعلها 10 ٪ بين عشية وضحاها الفورمالين محايدة مخزنة في درجة حرارة الغرفة. بعد التثبيت ، وتغسل 10 ٪ محايدة بعيدا مخزنة الفورمالين مع O 2 H المقطر ووضع أشرطة النسيجية في 4 درجات مئوية في برنامج تلفزيوني التقييم حتى النسيجية. 7. التقييم : علم الأنسجة (H & E) والمناعية (hCD31) النسيجي للتقييم ، هي جزء لا يتجزأ من يزرع في البارافين ومقطوع (7 ميكرون سميكة المقاطع) النسيجية باستخدام إجراءات القياسية. قياس كثافة microvessel بواسطة تقييم المقاطع (H & E) وHematoxilin يوزين ملون مأخوذ من الجزء الأوسط من يزرع. ويمكن الاطلاع على البروتوكولات القياسية لH & E تلطيخ أماكن أخرى. ويمكن التعرف على الهياكل Microvessels lumenal تحتوي خلايا الدم الحمراء. تقرير microvessels الكثافة ومتوسط عدد خلايا الدم الحمراء المليئة microvessels من الحقول تحليلها وأعرب والسفن / مم 2. وينبغي للتدليل على الطبيعة البشرية من السفن الاوعية الدموية الدقيقة ، مقاطع من زرع استرجاع تكون ملطخة immunohistochemically مع CD31 الإنسان محددة (hCD31) الأجسام المضادة باستخدام بروتوكولات تلطيخ القياسية. نوصي باستخدام الماوس وحيدة النسيلة المضادة البشرية CD31 الضد من DakoCytomation (استنساخ JC70A ؛ القط # M0823) في التخفيف 1:100. وقد أكد على خصوصية الإنسان لهذه الأجسام المضادة التي يتم الحصول عليها رد فعل سلبي مع مجموعة متنوعة من الأنسجة الماوس المقاطع التي كانت ملطخة 7،11 في متوازي. من المذكرة ، وغالبا ما ينظر الأوعية الدموية داخل يزرع الماوس (خاصة حول الحدود) ، ولكن السفن الماوس ولن صمة ايجابية مع هذا الجسم المضاد. بالإضافة ، يمكن الكشف عن وجود للجنة السلامة البحرية الإنسان مع الإنسان تلطيخ المناعى محددة أو أجسام مضادة ضد CD90 α الناعم أكتين العضلات (α – SMA). تم العثور على MSC الإنسان سواء في المنطقة المحيطة بالأوعية الأوعية الدموية التي تشكلت حديثا ويقع في جميع أنحاء interstitially زرع 11. 8. ممثل النتائج الشكل 1. مظهر نموذجي ECFC MSC والثقافات. micrographs النقيض من مرحلة ظهور عرض نموذجي من ECFCs واللجان الدائمة في مجال الثقافة. (A) أحادي الطبقة مندمج من ECFCs الدم المستمدة من الحبل عرض مميزة رصف الحجارة مورفولوجيا الخلايا البطانية. (ب) الإنسان نخاع العظام المستمدة من اللجان الدائمة التشكل عرض على شكل مغزلي. مقلحة القضبان ، و 200 أم. الشكل 2. ظهور شمعات explanted في يوم 7. كانت جزءا لا يتجزأ من الإنسان المستمدة من الدم والنخاع ECFCs نخاع العظام المستمدة من اللجان الدائمة في الكولاجين / فبرونيكتين / الليفين جل وزرعها تحت الجلد في الفئران عارية كما هو موضح في النص. (A) بعد 7 أيام ، بمجرد الماوس الموت الرحيم ، وقطع الجلد مفتوحة بالقرب من منطقة الحقن وكشف الخلية المكونات / هلام التقليب بواسطة الجلد. (ب) المظهر من المكونات ازالتها جراحيا من الماوس وقبل التثبيت الفورمالين. اللون الأحمر من عملية الزرع هو مؤشر على الأوعية الدموية. الشكل 3. النسيجي تحديد شبكة الأوعية الدموية في المقابس explanted. وHematoxilin يوزين (H & E) المقاطع الملون مأخوذ من الجزء الأوسط من المقابس explanted. (أ) التكبير المنخفض (10X) صورة مجهرية عرض الزرع (تميزت خط أصفر متقطع) في سياق الأنسجة المحيطة المضيف (أي الأنسجة الدهنية والعضلات والهيكل العظمي). (ب) التكبير السامية (40X) صورة مجهرية microvessels عرض متعددة (أصفر رأس السهم يشير إلى بعض منهم) داخل التيار ، ويمكن التعرف على الهياكل microvessels lumenal تحتوي خلايا الدم الحمراء. الشكل 4. المناعى تحديد الإنسانشمعة. أقسام Immunohistochemically ملون مأخوذ من الجزء الأوسط من المقابس explanted. ونفذت خارج تلوين استخدام الماوس وحيدة النسيلة المضادة البشرية CD31 (hCD31) الضد من DakoCytomation (استنساخ JC70A ؛ القط # M0823) في التخفيف 1:100 ؛ counterstained كانت نواة الخلية مع hematoxilin. (أ) التكبير المنخفض (10X) صورة مجهرية عرض الزرع (والمرسومة بخط أسود متقطع) في سياق الأنسجة المحيطة المضيف. هي ملطخة الإنسان محددة ، CD31 إيجابي microvessels باللون البني (تلوين البيروكسيداز). (ب) عالية التكبير (40X) عرض صورة مجهرية متعددة microvessels الإنسان (رأس السهم الأسود لافتا في بعض شمعة hCD31 إيجابية) داخل القابس.
Discussion
هذا هو نموذج تجريبي لشبكات الهندسة الحيوية الأوعية الدموية البشرية. الخصائص الرئيسية لهذا النموذج هي : 1) تتكون من خلايا الإنسان microvessels معزولة عن الأنسجة بعد الولادة (أي والدم ونخاع العظام) ، 2) يتم تشكيل microvessels في حيوان بالغ ، و 3) microvessels لا تنشأ من قبل القائمة (المضيف) ولكن بدلا من السفن التي تتشكل فيها ، من جديد ، واحدة من خلايا معلقة في مادة هلامية مناسبة.
الأوعية الدموية تلعب دورا هاما في هذا الاختبار لأن هناك حاجة إلى وصلات الأوعية الدموية الفئران لتحقيق الخلايا الحمراء المليئة الأوعية الدموية ، واحدة من وظيفية للقراءة في هذا الاختبار. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تجنيد خلايا الدم النخاعي المضيف لعملية الزرع في زرع في وقت مبكر بعد أيام ، وأنها ضرورية لتكوين الأوعية الدموية الجديدة سرير 12.
هذا النموذج التجريبي يقدم تنوعا ، ونظام نموذجي للقياس الكمي ، وبسيطة نسبيا لدراسة ما بعد الولادة تشكيل شبكات الأوعية الدموية في الجسم الحي الإنسان. بالإضافة إلى ذلك ، هذا الاختبار بسيط لأداء وأنها لا تحتاج إلى شق أو إجراء العمليات الجراحية. ويمكن استخدام النموذج لدراسة الامكانيات مكون للأوعية مصادر مختلفة من الخلايا البطانية والإنسان حول الوعاء. ويمكن استخدام هذا النموذج على الشاشة لمكافحة و- / أو مركبات الموالية للمكون للأوعية. أخيرا ، يمكن استخدام نموذج لدراسة دور (ق) من جينات معينة في تشكيل وظيفة الأوعية الدموية لشبكة تتألف من البطانة الإنسان.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل جزئيا من خلال منحة المعاهد الوطنية للصحة K99EB009096 – 01A1 إلى JM – M.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Endothelial Basal Medium, EBM-2 | Lonza | CC-3156 | |
| EGM-2 SingleQuot supplements | Lonza | CC-3162 | |
| Glutamine-penicillin-streptomycin solution, 100x GPS | Mediatech, Inc. | 30-009-CI | |
| Mesenchymal Stem Cell Growth Medium BulletKit, MSCBM/MSCGM | Lonza | PT-3001 | |
| High glucose Dulbecco’s Modified Eagle Medium, 1x DMEM | Invitrogen | 11995-073 | |
| MEM Non-essential amino acid solution, 100x NEAA | Invitrogen | 11140-050 | |
| High glucose Dulbecco’s Modified Eagle, powdered DMEM | Invitrogen | 12100-046 | |
| HEPES Buffer solution | Invitrogen | 15630-080 | |
| Cultrex Bovine Collagen I solution | Trevigen | 3442-050-01 | |
| Cultrex Human Fibronectin | Trevigen | 3420-001-01 | |
| Fibrinogen from bovine plasma | Sigma-Aldrich | F8630-1G | |
| Gelatin | Fisher | DF0143-17-9 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline, PBS | Invitrogen | 14190-250 | |
| Trypsin-EDTA solution, 1x | Invitrogen | 25300-054 | |
| Isoflurane, liquid for inhalation | Buxter Healthcare Corporation | NDC 10019-360-40 | |
| Thrombin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | T4648-1KU | |
| Formalin Solution, Neutral Buffered | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Monoclonal Mouse Anti-Human CD31 Antibody | DakoCytomation | M0823 | Clone JC70A |
References
- Melero-Martin, J. M., Bischoff, J. Chapter 13. An in vivo experimental model for postnatal vasculogenesis. Methods Enzymol. 445, 303-329 (2008).
- Koike, N. Tissue engineering: creation of long-lasting blood vessels. Nature. 428, 138-139 (2004).
- Schechner, J. S. In vivo formation of complex microvessels lined by human endothelial cells in an immunodeficient mouse. Proc Natl Acad Sci USA. 97, 9191-9196 (2000).
- Nö, r., E, J. Engineering and characterization of functional human microvessels in immunodeficient mice. Lab Invest. 81, 453-463 (2001).
- Lin, Y., Weisdorf, D. J., Solovey, A., Hebbel, R. P. Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood. J Clin Invest. 105, 71-77 (2000).
- Ingram, D. A. Identification of a novel hierarchy of endothelial progenitor cells using human peripheral and umbilical cord blood. Blood. 104, 2752-2760 (2004).
- Melero-Martin, J. M. In vivo vasculogenic potential of human blood-derived endothelial progenitor cells. Blood. 109, 4761-4768 (2007).
- Au, P. Differential in vivo potential of endothelial progenitor cells from human umbilical cord blood and adult peripheral blood to form functional long-lasting vessels. Blood. 111, 1302-1305 (2008).
- Yoder, M. C. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109, 1801-1809 (2007).
- Traktuev, D. Robust Functional Vascular Network Formation In Vivo by Cooperation of Adipose Progenitor and Endothelial Cells. Circ Res. 104, 1410-1420 (2009).
- Melero-Martin, J. M. Engineering robust and functional vascular networks in vivo with human adult and cord blood-derived progenitor cells. Circ Res. 103, 194-202 (2008).
- Melero-Martin, J. M. Host Myeloid Cells Are Necessary for Creating Bioengineered Human Vascular Networks In Vivo. Tissue Eng Part A. 16, 2457-2466 (2010).
Tags
BioengineeringHuman Microvascular NetworksImmunodeficient MiceCell-based TherapiesVascular NetworksIn Vivo ModelsEndothelial CellsAutologous Endothelial CellsClinical UseEndothelial Colony-forming CellsBlood-derived ECsFunctional Vascular NetworksPerivascular CellsCord Blood-derived ECFCsMesenchymal Stem Cells (MSCs)Collagen/fibronectin/fibrinogen Gel
Cite This Article
Lin, R., Melero-Martin, J. M. Bioengineering Human Microvascular Networks in Immunodeficient Mice. J. Vis. Exp. (53), e3065, doi:10.3791/3065 (2011).