Bioingénierie de l'homme Réseaux microvasculaires chez des souris immunodéficientes

1. Préparation Faire EGM-2 moyennes (500 ml) Ajouter 100 ml de sérum de veau fœtal (SVF) à 395 ml de milieu de base endothéliale (EBM-2). Ajouter 5 ml de 100x Glutamine-pénicilline-streptomycine solution de localisation (GPS). Ajouter tous les EGM-2 suppléments SingleQuots sauf pour l'hydrocortisone (ie, le VEGF, hFGF-B, R-IGF-1, hEGF, l'héparine, l'acide ascorbique, et GA-1000). Filtre stérilisée avec un 0,2-um filtre de taille des pores sous vide. Faire moyennes MSCGM (500 ml) Ajouter 5 ml de GPS 100x à 440 mL de milieu base de la tige mésenchymateuses cellulaire (MSCBM). Ajouter tout le contenu de la trousse MSCGM SingleQuots. Ajouter hFGF-B aliquote de suppléments SingleQuots EGM-2. Filtre stérilisée avec un 0,2-um filtre de taille des pores sous vide. Faire du milieu DMEM (500 ml) Ajouter 50 ml de sérum de veau fœtal (SVF) à 440 ml de glucose à haute 1x Medium Eagle modifié par Dulbecco (DMEM). Ajouter 5 ml de GPS 100x. Ajouter 5 ml de solution d'acide aminé non essentiel. Filtre stérilisée avec un 0,2-um filtre de taille des pores sous vide. Faire collagène / fibronectine solution (3,6 ml; faite le jour même de l'injection) Ajouter 0,4 ml de DMEM 10x à 150 uL d'eau distillée H 2 O. Ajouter 100 ul de HEPES 1M (25 mM final). Soigneusement, ajouter 2,4 ml de collagène bovin (5 mg / mL de stock; 3 mg / ml final) et mélanger doucement sur la glace. Ajuster le pH à neutralité par l'adjonction de NaOH 1N solution (environ 30 uL). Utilisez indicateur rouge de phénol pour évaluer pH neutre; alternative, utiliser du papier indicateur de pH pour contrôler le pH. Ajouter 120 ul de fibronectine humaine (1 mg / mL de stock; 30 pg / ml final) Ajouter 0,4 ml de FBS (10% final) Garder la solution sur la glace jusqu'à utilisation. Faire solution de fibrinogène (1 ml; faite le jour même de l'injection) Ajoutez 30 mg de fibrinogène poudre à 1 ml de NaCl 0.9N (pH 7,4) solution (30 mg / ml final). Avant d'utiliser, incuber la solution de fibrinogène à 37 ° C pendant 30 minutes. Mélanger doucement, sans agitation, avant son addition au gel de collagène / fibronectine. Faire solution de thrombine (200 ml) Ajouter une KU de la thrombine en poudre à 200 ml de solution saline de NaCl 0,9% de la normale (50 U / ml). Filtre stérilisée avec un filtre de 0,2 um-taille de la seringue pores et conserver à -20 ° C jusqu'à utilisation. Avant utilisation, diluer avec une solution saline normale à 0,9% de NaCl à une concentration finale de 10 U / ml. Faire une solution de gélatine% (500 ml) Ajouter 5 g de gélatine en poudre à 500 ml de phosphate de Dulbecco saline tamponnée (PBS). Autoclave à 121 ° C pendant 30 min. Filtre stérilisée avec un 0,2-um filtre de taille des pores sous vide. Manteau de 100 mm des plaques de culture tissulaire avec solution d'enrobage gélatine à 1% Ajouter 10 ml de solution de gélatine à 1% à chaque plaque de 100 mm de culture de tissu. Incuber les plaques à 37 ° C pendant 60 min. Avant l'utilisation, enlever la solution de gélatine et laver les plaques une fois avec du PBS. 2. Culture de cordon humain dérivés du sang endothéliale cellules formant des colonies (CPEF) Ce protocole suppose flacons congelés du ECFC sont disponibles dans le laboratoire avant cette expérience. ECFC peut être isolé de la fraction de cellules mononucléaires du sang de cordon ombilical soit ou adulte sang périphérique, comme décrit précédemment 7. Décongelez un flacon de CPEF (typiquement 0,5-1×10 6 cellules dans 1 ml de milieu de congélation) prises à partir du réservoir de stockage d'azote liquide et immédiatement diluer son contenu dans un tube conique de 15 mL contenant 10 mL de milieu DMEM. Spin à 1200 rpm pendant 5 min. Retirer le surnageant et remettre le culot cellulaire dans 10 ml d'eau tiède EGM-2 moyennes. Ajouter les 10 mL de suspension ECFC dans un 1% de gélatine à revêtement de 100 mm plaque de culture de tissus. Placer la plaque dans un incubateur humidifié à 37 ° C et 5% de CO 2. Le lendemain, doucement aspirer à des cellules non liée et moyennes entreprises, et de nourrir les cellules lié avec 10 ml de frais EGM-2 moyennes. Flux de la plaque tous les 2-3 jours avec EGM-2 moyennes. Permettent aux cellules de l'expansion de telle sorte que la plaque est recouverte par une monocouche confluente cellulaire. A confluence, les cellules sous-culture comme suit: Aspirer le milieu de culture et laver les cellules avec 10 ml de PBS. Retirer du PBS et ajouter 2 mL de solution de trypsine-EDTA à chaque plaque de 100 mm. Secouez délicatement les plaques pour répartir uniformément la solution de trypsine-EDTA. Incuber à 37 ° C et 5% de CO 2 pendant 3-5 minutes. Tapoter doucement la plaque pour voir les cellules détachées en suspension sous un microscope inversé. Lorsque les cellules détacher complètement, ajouter 8 ml d'EGM-2 moyennes et recueillir la solution cellulairetion dans un tube de 15 ml conique. Prenez 10 uL de compter les cellules dans un hémocytomètre et de travailler sur le nombre total de cellules récoltées. Plaque les cellules de 1% de gélatine revêtement des plaques de culture tissulaire à une densité d'ensemencement de 5000 cellules / cm 2 à l'aide EGM-2 moyennes. Placer les plaques dans l'incubateur et de les nourrir tous les 2-3 jours avec EGM-2 moyennes. Répétez cette procédure pour les passages ultérieurs. Gardez une trace du nombre passage comme la population cellulaire est élargi. CPEF seront utilisées entre les passages 4-8. 3. Culture de moelle osseuse humaine des cellules dérivées de souches mésenchymateuses (CSM) Ce protocole suppose flacons congelés du MSC humaines sont disponibles dans le laboratoire avant cette expérience. MSC peut être isolé de la moelle osseuse aspire, comme décrit précédemment 11. Décongelez un flacon de cellules souches mésenchymateuses (généralement 0,50 1×10 6 cellules dans 1 ml de milieu de congélation) prises à partir du réservoir de stockage d'azote liquide et immédiatement diluer son contenu dans un tube conique de 15 mL contenant 10 mL de milieu DMEM. Spin à 1200 rpm pendant 5 min. Retirer le surnageant et remettre le culot cellulaire dans 10 mL de milieu MSCGM chaud. Ajouter les 10 mL de la suspension du SMC en un seul non couché de 100 mm plaque de culture de tissus. Placer la plaque dans un incubateur humidifié à 37 ° C et 5% de CO 2. Le lendemain, doucement aspirer à des cellules non liée et moyennes entreprises, et de nourrir les cellules lié avec 10 mL de milieu MSCGM frais. Flux de la plaque tous les 2-3 jours avec un milieu de MSCGM. Permettent aux cellules de l'expansion de telle sorte que la plaque atteint 80% de monocouche cellulaire confluente. Au confluent de 80%, sous-culture des cellules comme suit: Aspirer le milieu de culture et laver les cellules avec 10 ml de PBS. Retirer du PBS et ajouter 2 mL de solution de trypsine-EDTA à chaque plaque de 100 mm. Secouez délicatement les plaques pour répartir uniformément la solution de trypsine-EDTA. Incuber à 37 ° C et 5% de CO2 pendant 3-5 minutes. Tapoter doucement la plaque pour voir les cellules détachées en suspension sous un microscope inversé. Lorsque les cellules détacher complètement, ajouter 8 ml de milieu MSCGM et recueillir la solution de cellules dans un tube de 15 ml conique. Prenez 10 uL de compter les cellules dans un hémocytomètre et de travailler sur le nombre total de cellules récoltées. Plaque les cellules non couché plaques de culture tissulaire à une densité de semis de 10 000 cellules / cm 2 en utilisant le milieu MSCGM. Placer les plaques dans l'incubateur et de les nourrir tous les 2-3 jours avec un milieu de MSCGM. Répétez cette procédure pour les passages ultérieurs. Gardez une trace du nombre passage comme la population cellulaire est élargi. MSC seront utilisées entre les passages 4-8. 4. Resuspension des cellules dans du collagène / fibronectine / fibrinogène Solution (jour 0) Avant l'expérience, assurez-vous il ya assez de CPEF et les MSC dans la culture; 0.8×10 1.2×10 6 CPEF et les cellules souches mésenchymateuses 6 sera requis pour chaque implant et de la souris. Aspirer le milieu de chaque plaque de culture et laver les cellules avec 10 ml de PBS. Retirer du PBS et ajouter 2 mL de solution de trypsine-EDTA à chaque plaque de 100 mm. Secouez délicatement les plaques pour répartir uniformément la solution de trypsine-EDTA. Incuber pendant 3-5 minutes. Tapoter doucement la plaque pour voir les cellules détachées en suspension sous un microscope inversé. Lorsque les cellules détacher complètement, ajouter 8 ml de milieu DMEM et recueillir la solution de cellules dans un tube de 15 ml conique. Prenez 10 uL de compter les cellules dans un hémocytomètre et de travailler sur le nombre total de CPEF et les MSC récoltés. Transfert 4×10 6 CPEF (5x 0.8×10 6 cellules) et 6×10 6 PPM (5x 1.2×10 6 cellules) ainsi que dans une seule de 50 ml tube conique. Il s'agit du montant total de cellules nécessaires pour cinq implants individuels et les souris. Centrifuger à 1200 rpm et éliminer le surnageant. Doucement, ajouter 100 uL de solution de fibrinogène à 0,9 ml de collagène / fibronectine solution (3 mg / ml concentration de fibrinogène final); maintenir le mélange sur la glace. Reprendre le culot cellulaire sur 1 ml de glace froide collagène / fibronectine / fibrinogène solution; mélanger les cellules très doucement pour éviter les bulles. Chargez le mélange dans une seringue stérile de 1 ml, et le lieu d'une aiguille de calibre 26 avec son capuchon sur le bout de la seringue. Conserver la seringue chargée sur glace jusqu'à l'injection. 5. L'injection dans la souris Nude immunodéficientes (jour 0) Toutes les expériences sur les animaux seront effectués avec âgées de 6 semaines nude athymiques (nu / nu) chez la souris. Avant l'injection, anesthésier la souris immunodéficientes en les plaçant dans une chambre à gaz offrant l'isoflurane. Autoriser les souris à inhaler l'isoflurane pendant environ 2 minutes jusqu'à ce qu'ils soient anesthésiés et insensible à pincement de l'orteil (surveiller leurs battements de cœur par l'inspection). Pour chaque souris, injecter 50 uL de solution de thrombine (10 U / ml) sous-cutanée dans la région dorsale supérieure en utilisant une aiguille de calibre 26. <li> Dans le même endroit où la thrombine a été injecté, injecter 200 uL du mélange de cellules à l'aide d'une aiguille de calibre 26. Collagène de gel à 37 ° C et le fibrinogène sera sous forme de gel de fibrine en présence de thrombine. En conséquence, l'implant doit former une petite mais appréciable, bosse sous la peau. Après l'injection, placez la souris sur une couche de gaze pour le confort et la chaleur et de les observer jusqu'à ce qu'ils deviennent ambulatoires. Puis après, observer la souris par jour pendant les trois premiers jours. 6. Récolte (Jour 7) Une semaine après les injections, euthanasier les souris en les plaçant dans une chambre à gaz comprimé offrant gaz CO 2. Une fois euthanasiés, à ciel ouvert de la peau à proximité de la zone de l'injection et enlever chirurgicalement la fiche de gel. Des photos numériques des bouchons de gel récupéré avec une échelle est conseillé. Placez les bougies gel de la récolte dans la cassette histologiques et profonde eux dans 10% du formol tamponné neutre nuit à température ambiante. Après fixation, lavez les 10% du formol tamponné neutre éliminer H 2 O distillée et placer les cassettes histologiques à 4 ° C dans du PBS jusqu'à l'évaluation histologique. 7. Évaluation: Histologie (H & E) et immunohistochimie (hCD31) Pour l'évaluation histologique, les implants sont inclus dans la paraffine et sectionnés (7 um d'épaisseur des sections) en utilisant les procédures standard histologique. Quantifier la densité des microvaisseaux par l'évaluation de hématoxiline et l'éosine (H & E) sections colorées tirées de la partie centrale de l'implant. Des protocoles standard de coloration H & E peut être trouvé ailleurs. Microvaisseaux peuvent être identifiés en tant que structures luminal contenant des globules rouges. Signaler densité microvaisseaux que le nombre moyen de globules rouges remplis de microvaisseaux dans les domaines analysés et exprimés en bateaux / mm 2. Afin de démontrer la nature humaine des vaisseaux microvasculaires, des sections de l'implant doit être récupéré par immunohistochimie colorées avec un CD31 humain spécifique (hCD31) antibody utilisant des protocoles standard de coloration. Nous vous recommandons d'utiliser l'anticorps monoclonal de souris anti-humain CD31 anticorps à partir de DakoCytomation (Clone JC70A;. # Cat M0823) à une dilution de 1:100. La spécificité de cet anticorps humains a été confirmée par la réaction négative obtenue avec une diversité de sections de tissus de souris qui ont été colorées en 7,11 parallèle. Fait à noter, les vaisseaux sanguins de souris sont souvent vu à l'intérieur des implants (spécialement autour de la frontière), mais les navires de la souris ne tache pas positif avec cet anticorps. En outre, la présence de CSM humaines peuvent être détectés par coloration immunohistochimique avec des anticorps spécifiques humaine contre CD90 ou de l'actine musculaire lisse α-(α-SMA). MSC humaines sont trouvées à la fois dans la région périvasculaire des vaisseaux sanguins nouvellement formés et répartis sur l'ensemble interstitiellement l'implant 11. 8. Les résultats représentatifs Figure 1. Aspect typique de la ECFC et cultures du MSC. Micrographies en contraste de phase montrant l'aspect typique de CPEF et les MSC en culture. (A) monocouche confluente de sang de cordon dérivés CPEF affichant la caractéristique pavées morphologie des cellules endothéliales. (B) d'os humains provenant de la moelle MSC affichant une morphologie forme de broche. Scaler bars, 200 um. Figure 2. Apparence de bouchons explantés au jour 7. Dérivés du sang du cordon humain CPEF et les os dérivées de la moelle MSC ont été incorporés dans le collagène / fibronectine / fibrine gel et implantation sous-cutanée à des souris nude comme décrit dans le texte. (A) Après 7 jours, une fois que la souris a été euthanasiée, à ciel ouvert de la peau à proximité de la zone de l'injection et d'exposer la fiche de cellules / gel en retournant la peau. (B) Aspect de la fiche chirurgicalement enlevé de la souris et avant la fixation au formol. La couleur rouge de l'implant est une indication de la vascularisation. Figure 3. L'identification histologique des réseau vasculaire dans les bouchons explantés. Hématoxiline et l'éosine (H & E) sections colorées tirées de la partie du milieu des bouchons explantés. (A) à faible grossissement (10x) Micrographie montrant l'implant (marquée par une ligne jaune pointillée) dans le cadre des tissus de l'hôte environnante (par exemple, le tissu adipeux et le muscle squelettique). (B) à fort grossissement (40x) Micrographie montrant plusieurs microvaisseaux (flèche jaune pointant vers certains d'entre eux) l'intérieur du bouchon; microvaisseaux peuvent être identifiés en tant que structures luminal contenant des globules rouges. Figure 4. L'identification immunohistochimique des humainslumens. immunohistochimique coupes colorées tirées de la partie du milieu des bouchons explantés. La coloration a été réalisée en utilisant un anticorps monoclonal de souris anti-humain CD31 (hCD31) anticorps à partir de DakoCytomation (Clone JC70A;. # Cat M0823) à une dilution 1:100; noyaux des cellules ont été contre-colorées avec hématoxiline. (A) à faible grossissement (10x) Micrographie montrant l'implant (délimitée par une ligne pointillée noire) dans le contexte de tissus environnants hôte. Humaines spécifiques, CD31-positives microvaisseaux sont colorées en brun (coloration peroxydase). (B) Haute grossissement (40x) Micrographie montrant plusieurs microvaisseaux humains (flèche noire pointant à certains lumens hCD31-positif) à l'intérieur du bouchon.