האדם Bioengineering רשתות כלי הדם של עכברים Immunodeficient

1. הכנה הפוך את EGM-2 בינוני (500 מ"ל) מוסיפים 100 מ"ל של סרום שור העובר (FBS) עד 395 מ"ל של מדיום בסל האנדותל (EBM-2). הוסף 5 מ"ל של תמיסת גלוטמין, פניצילין, סטרפטומיצין 100x (GPS). הוסף את כל EGM-2 תוספי SingleQuots למעט הידרוקורטיזון (דהיינו, VEGF, hFGF-B, R-IGF-1, hEGF, הפרין, חומצה אסקורבית, ו GA-1000). סנן מעוקר עם מסנן 0.2-מיקרומטר גודל הנקבוביות ואקום. בצע בינוני MSCGM (500 מ"ל) הוסף 5 מ"ל של GPS 100x עד 440 מ"ל של תא mesenchymal בינוני בסל גזע (MSCBM). הוסף את כל תכולת הערכה MSCGM SingleQuots. הוסף hFGF aliquot-B-2 מ EGM תוספי SingleQuots. סנן מעוקר עם מסנן 0.2-מיקרומטר גודל הנקבוביות ואקום. הפוך את DMEM בינוני (500 מ"ל) הוסף 50 מ"ל של סרום שור העובר (FBS) עד 440 מ"ל של גלוקוז גבוהה 1x השתנה Dulbecco הנשר בינוני (DMEM). הוסף 5 מ"ל של GPS 100x. הוסף 5 מ"ל של תמיסת חומצת אמינו חיוניות. סנן מעוקר עם מסנן 0.2-מיקרומטר גודל הנקבוביות ואקום. הפוך את הקולגן / פיברונקטין פתרון (3.6 מ"ל; באותו יום עשוי הזרקה) הוסף 0.4 מ"ל של DMEM 10x עד 150 μL של מזוקקים H 2 O. הוספת 100 μL של HEPES 1M (25 mM הסופי). בזהירות, להוסיף 2.4 מ"ל של קולגן שור (5 מ"ג / מ"ל ​​המניות; 3 מ"ג / מ"ל ​​הסופי) ומערבבים בעדינות על הקרח. התאם את ה-pH נייטרלי אל ידי הוספת פתרון 1N NaOH (כ 30 μL). השתמש אינדיקטור פנול אדום להעריך pH נייטרלי; חלופיים, שימוש מבחן נייר pH לפקח pH. הוספת 120 μL של פיברונקטין האדם (1 מ"ג / מ"ל ​​המניות; 30 מיקרוגרם / מ"ל ​​הסופי) הוסף 0.4 מ"ל של FBS (10% הסופי) פתרון לשמור על הקרח עד לשימוש. בצע פתרון פיברינוגן (1 מ"ל; באותו יום עשוי הזרקה) הוסף 30 מ"ג של פיברינוגן אבקת ל 1 מ"ל של 0.9N NaCl (pH 7.4) פתרון (30 מ"ג / מ"ל ​​הסופי). לפני השימוש, דגירה הפתרון פיברינוגן על 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. מערבבים בעדינות, בלי vortexing, לפני כן על מנת ג'ל קולגן / פיברונקטין. בצע פתרון תרומבין (200 מ"ל) הוסף 1 KU של תרומבין אבקת עד 200 מ"ל של תמיסת מלח NaCl 0.9% נורמלי (50 U / mL). סנן מעוקר עם מסנן-0.2 מיקרומטר מזרק נקבוביות גודל החנות ב -20 ° C עד השימוש. לפני השימוש, לדלל עם סליין 0.9% NaCl רגיל לריכוז סופי של 10 U / mL. בצע פתרון ג'לטין 1% (500 מ"ל) הוסף 5 גרם אבקת ג'לטין 500 מ"ל של פוספט של Dulbecco בופר סליין (PBS). Autoclaved ב 121 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. סנן מעוקר עם מסנן 0.2-מיקרומטר גודל הנקבוביות ואקום. 100 מ"מ מעיל רקמה תרבות צלחות עם פתרון 1% ציפוי ג'לטין הוסף 10 מ"ל של תמיסת ג'לטין 1% לכל צלחת 100 מ"מ בתרבית רקמה. דגירה צלחות על 37 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות. לפני השימוש, להסיר את הפתרון ג'לטין ולשטוף את הצלחות פעם עם PBS. 2. תרבות של דם טבורי האדם נגזר האנדותל המושבה תאים יוצרי (ECFCs) פרוטוקול זה מניח צלוחיות קפוא של ECFC זמינים במעבדה לפני הניסוי הזה. ECFC יכול להיות מבודד שבריר התא mononuclear הדם או חבל הטבור או דם היקפי מבוגר כפי שתואר לעיל 7. One הפשירי בקבוקון של ECFCs (בדרך כלל 0.5-1×10 6 תאים למ"ל 1 של מדיה הקפאה) שנלקחו מיכל חנקן נוזלי אחסון ומיד לדלל תוכנו בצינור 15 מ"ל חרוטי המכיל 10 מ"ל של מדיום DMEM. ספין בסל"ד 1200 דקות 5. הסר supernatant ו resuspend התא גלולה ב 10 מ"ל של מדיום EGM-2 חמים. מוסיפים 10 מ"ל של השעיה ECFC אל% 1 אחת ג'לטין מצופה 100 מ"מ תרבות צלחת רקמות. מניחים את הצלחת חממה humidified ב 37 ° C ו 5% CO 2. למחרת, לשאוב בעדינות את התאים מאוגד ובינוניים, ולהאכיל התאים קשורים עם 10 מ"ל של מדיום EGM-2 טריים. הזנת את הצלחת כל 2-3 ימים עם בינוני EGM-2. אפשר להרחיב תאים כזה צלחת מכוסה בשכבה הסלולר ומחוברות. באותו מפגש, תת התאים כדלקמן: לשאוב את המדיום תרבות לשטוף את התאים עם 10 מ"ל של PBS. הסר PBS ומוסיפים 2 מ"ל של תמיסת EDTA-טריפסין לצלחת 100 מ"מ כל אחד. בעדינות את הסלע צלחות כדי לפזר באופן שווה את הפתרון טריפסין-EDTA. לדגור על 37 ° C ו 5% CO 2 עבור 3-5 דקות. לטפוח בעדינות את הצלחת לראות את התאים מנותק ההשעיה תחת מיקרוסקופ הפוכה. כאשר תאים לנתק לחלוטין, להוסיף 8 מ"ל של מדיום EGM-2 ו לאסוף את התא solution לשפופרת 15 מ"ל קונית. קח 10 μL לספור את התאים haemocytometer ולעבוד את המספר הכולל של תאים נקצרו. פלייט התאים 1% ג'לטין מצופה תרבות צלחות רקמות בצפיפות זריעה של תא 5000 / 2 ס"מ בעזרת EGM-2 בינוני. מקמי את הצלחות בחממה להאכיל אותם כל 2-3 ימים עם בינוני EGM-2. חזור על הליך זה עבור הקטעים הבאים. עקוב אחר מספר את המעבר כפי אוכלוסיית תאים מורחבת. ECFCs ישמש בין 4-8 קטעים. 3. תרבות של מח עצם האדם, נגזר גזע תאים mesenchymal (MSCs) פרוטוקול זה מניח צלוחיות קפוא של MSC אדם זמין במעבדה לפני הניסוי הזה. MSC יכול להיות מבודד מח עצם aspirates כפי שתואר לעיל 11. One הפשירי בקבוקון של MSCs (בדרך כלל 0.50-1×10 6 תאים מדיה 1 מ"ל הקפאה) שנלקחו מיכל חנקן נוזלי אחסון ומיד לדלל תוכנו בצינור 15 מ"ל חרוטי המכיל 10 מ"ל של מדיום DMEM. ספין בסל"ד 1200 דקות 5. הסר supernatant ו resuspend התא גלולה ב 10 מ"ל של מדיום MSCGM חם. מוסיפים 10 מ"ל של השעיה MSC לתוך אחד ללא ציפוי צלחת 100 מ"מ בתרבית רקמה. מניחים את הצלחת חממה humidified ב 37 ° C ו 5% CO 2. למחרת, לשאוב בעדינות את התאים מאוגד ובינוניים, ולהאכיל התאים קשורים עם 10 מ"ל של מדיום MSCGM טריים. הזנת את הצלחת כל 2-3 ימים עם בינוני MSCGM. אפשר להרחיב תאים כאלה צלחת מגיע 80% monolayer הסלולר ומחוברות. באותו מפגש 80%, תת התאים כדלקמן: לשאוב את המדיום תרבות לשטוף את התאים עם 10 מ"ל של PBS. הסר PBS ומוסיפים 2 מ"ל של תמיסת EDTA-טריפסין לצלחת 100 מ"מ כל אחד. בעדינות את הסלע צלחות כדי לפזר באופן שווה את הפתרון טריפסין-EDTA. לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 במשך 3-5 דקות. לטפוח בעדינות את הצלחת לראות את התאים מנותק ההשעיה תחת מיקרוסקופ הפוכה. כאשר תאים לנתק לחלוטין, להוסיף 8 מ"ל של מדיום MSCGM ולאסוף את הפתרון הנייד לתוך צינור 15 מ"ל קונית. קח 10 μL לספור את התאים haemocytometer ולעבוד את המספר הכולל של תאים נקצרו. פלייט התאים צלחות תרבות ציפוי רקמות בצפיפות זריעה של התא 10000 / 2 ס"מ בעזרת בינוני MSCGM. מקמי את הצלחות בחממה להאכיל אותם כל 2-3 ימים עם בינוני MSCGM. חזור על הליך זה עבור הקטעים הבאים. עקוב אחר מספר את המעבר כפי אוכלוסיית תאים מורחבת. MSCs ישמש בין 4-8 קטעים. 4. Resuspension של תאים פתרון קולגן / פיברונקטין / פיברינוגן (יום 0) לפני הניסוי, לוודא שיש מספיק ECFCs MSCs בתרבות; 0.8×10 6 ECFCs ו 1.2×10 6 MSCs יידרש שתל כל ועכבר. לשאוב את המדיום של כל צלחת תרבות לשטוף את התאים עם 10 מ"ל של PBS. הסר PBS ומוסיפים 2 מ"ל של תמיסת EDTA-טריפסין לצלחת 100 מ"מ כל אחד. בעדינות את הסלע צלחות כדי לפזר באופן שווה את הפתרון טריפסין-EDTA. דגירה של 3-5 דקות. לטפוח בעדינות את הצלחת לראות את התאים מנותק ההשעיה תחת מיקרוסקופ הפוכה. כאשר תאים לנתק לחלוטין, להוסיף 8 מ"ל של מדיום DMEM ולאסוף את הפתרון הנייד לתוך צינור 15 מ"ל קונית. קח 10 μL לספור את התאים haemocytometer ולעבוד את המספר הכולל של ECFCs ו MSCs שנקטפו. 4×10 העברת 6 ECFCs (5x 0.8×10 6 תאים) ו 6×10 6 MPCs (5x 1.2×10 6 תאים) יחד לתוך צינור 50 מ"ל יחיד חרוטי. זהו הסכום הכולל של תאים נדרשים חמישה שתלים עכברים בודדים. צנטריפוגה בסל"ד 1200 ולהסיר את supernatant. בעדינות, להוסיף 100 UL של פתרון פיברינוגן ל 0.9 מ"ל של תמיסת קולגן / פיברונקטין (3 מ"ג / מ"ל ​​ריכוז פיברינוגן הסופי); לשמור את התערובת על קרח. Resuspend התא גלולה על 1 מ"ל של תמיסת קרים קולגן / פיברונקטין / פיברינוגן, לערבב את התאים בעדינות רבה, כדי למנוע בועות. טען את התערובת לתוך מזרק 1 מ"ל סטרילי, ובמקום מחט 26-מד עם הכובע שלו על קצה המזרק. שמור את המזרק טעון על הקרח עד ההזרקה. 5. הזרקה לתוך עכבר עירום Immunodeficient (יום 0) כל הניסויים בבעלי חיים תבוצע עם 6 שבועות הישן athymic בעירום (נו / נו) בעכברים. לפני הזריקה, להרדים את העכברים immunodeficient ידי הצבתם לתוך תא גזים ומספק isoflurane. אפשר העכברים כדי לשאוף את isoflurane למשך כ 2 דקות עד שהם מורדמים ואינו מגיב לצבוט הבוהן (לפקח על פעימות הלב שלהם על ידי בדיקה). עבור כל עכבר, להזריק 50 μL של פתרון תרומבין (10 U / mL) תת עורי לאזור הגב העליון באמצעות מחט 26-מד. <li> במקום שבו תרומבין היה מוזרק, להזריק 200 μL של התערובת התא באמצעות מחט 26-מד. קולגן ג'ל יהיה ב 37 ° C ו פיברינוגן יהיה בצורת ג'ל הפיברין בנוכחות תרומבין. כתוצאה מכך, השתל צריך טופס קטן, אבל ניכר, בליטה מתחת לעור. לאחר הזריקה, המקום עכברים על שכבה של גזה לנוחות וחמימות ולבחון אותם עד שהם הופכים אמבולטורי. לאחר מכן, לבחון את העכברים מדי יום בשלושת הימים הראשונים. 6. קציר (יום 7) שבוע לאחר הזריקות, להרדים את העכברים ידי הצבתם לתוך תא גזים דחוסים אספקת גז CO 2. מורדמים פעם, לחתוך את העור בסמוך לאזור ההזרקה ואת להסיר בניתוח את התקע ג'ל. צילומים דיגיטליים של אטמי ג'ל לאחזר עם סולם מומלץ. מניחים את אטמי ג'ל שנקטפו לתוך קלטת היסטולוגית ועמוק אותם 10% נייטרלי שנאגרו פורמלין הלילה בטמפרטורת החדר. לאחר קיבוע, לשטוף את 10% נייטרלי שנאגרו פורמלין משם עם מזוקקים H 2 O והמקום קלטות היסטולוגית על 4 מעלות צלזיוס עד PBS הערכה היסטולוגית. 7. הערכה: היסטולוגיה (H & E) אימונוהיסטוכימיה (hCD31) לקבלת הערכה היסטולוגית, השתלים המוטבעים פרפין מחולק (7 מיקרומטר בעובי חלקים) באמצעות נהלים היסטולוגית רגילה. לכמת צפיפות microvessel על ידי הערכה של Hematoxilin ו Eosin (H & E) סעיפים מוכתם שנלקחו בחלק האמצעי של השתלים. פרוטוקולים סטנדרטיים עבור H & E מכתים ניתן למצוא במקומות אחרים. Microvessels ניתן לזהות מבנים lumenal המכילה כדוריות דם אדומות. דווח microvessels צפיפות כמו המספר הממוצע של תא דם אדום מלא microvessels מתחומי מנותח כפי שבאה לידי ביטוי כלי / 2 מ"מ. כדי להדגים את הטבע האנושי של כלי כלי הדם, קטעים של השתל לאחזר צריך להיות מוכתם immunohistochemically עם אדם ספציפי CD31 (hCD31) נוגדן תוך שימוש בפרוטוקולים סטנדרטיים מכתים. אנו ממליצים להשתמש בעכבר חד שבטיים אנטי אנושי CD31 נוגדנים מן DakoCytomation (Clone JC70A;. חתול # M0823) בשעה דילול 1:100. סגוליות של נוגדן אנושי זו אושרה על ידי תגובה שלילית שהושג עם מגוון של רקמות העכבר סעיפים שהיו מוכתמים ב 7,11 במקביל. שים לב, כלי דם העכבר נראים לעתים קרובות בתוך השתלים (במיוחד סביב הגבול), אבל כלי העכבר לא יהיה כתם חיוביות עם נוגדן זה. בנוסף, נוכחות של MSC האדם ניתן להבחין באמצעות מכתים immunohistochemical עם אדם ספציפי נוגדנים כנגד CD90 או α-Smooth אקטין שריר (α-SMA). MSC האדם נמצאים גם באזור perivascular החדש של יצרו כלי דם הממוקמים ברחבי interstitially השתל 11. 8. נציג תוצאות באיור 1. מראה אופייני של ECFC ותרבויות MSC. בניגוד micrographs שלב הצגת מראה אופייני ECFCs ו MSCs בתרבות. (א) monolayer ומחוברות דם טבורי שמקורם ECFCs הצגת מורפולוגיה אופיינית חלוק אבן של בתאי האנדותל. (ב) אדם מח עצם הנגזרות MSCs הצגת מורפולוגיה צורה ציר. Scaler ברים, אממ 200. איור 2. מראה של אטמי explanted ביום 7. דם חבל הטבור נגזר האדם ECFCs ועצמות מח הנגזרות MSCs היו משובצים קולגן / פיברונקטין / הפיברין ג'ל מושתל מתחת לעור לעכברים בעירום כמתואר בטקסט. (א) לאחר 7 ימים, פעם אחת על העכבר כבר מורדמים, לחתוך את העור בסמוך לאזור הזריקה ולחשוף את התקע תא / ג'ל על ידי מרפרף על העור. (ב) מראה של התקע הוסר בניתוח של העכבר לפני קיבוע בפורמלין. הצבע האדום של השתל היא אינדיקציה של כלי הדם. איור 3. זיהוי היסטולוגית של רשת כלי דם בתוך תקעים explanted. Hematoxilin ו Eosin (H & E) סעיפים מוכתם שנלקחו בחלק האמצעי של אטמי explanted. (א) בהגדלה נמוכה (10x) מיקרוסקופ הצגת השתל (מסומן בקו מקווקו צהוב) בהקשר של הרקמות סביב המארח (כלומר, רקמת שומן שרירי השלד). (ב) הגדלה גבוהה (40X) מיקרוסקופ microvessels מרובות הצגת (צהוב ראש החץ מצביע על חלק מהם) בתוך התקע; microvessels ניתן לזהות מבנים lumenal המכילה כדוריות דם אדומות. איור 4. זיהוי immunohistochemical של האדםלומן. Immunohistochemically סעיפים מוכתם שנלקחו בחלק האמצעי של אטמי explanted. מכתים בוצע באמצעות העכבר חד שבטיים אנטי אנושי CD31 (hCD31) נוגדנים מן DakoCytomation (Clone JC70A;. חתול # M0823) בשעה דילול 1:100; גרעיני תאים היו counterstained עם hematoxilin. (א) בהגדלה נמוכה (10x) מיקרוסקופ הצגת השתל (המסומנים בקו מקווקו שחור) בהקשר של הרקמות סביב המארח. אדם ספציפי, CD31 חיובי microvessels מוכתמים בצבע חום (מכתים peroxidase). (ב) מיקרוסקופ גבוהה (40X) הגדלה הצגת מספר האנושי microvessels (ראש חץ שחור מצביע על כמה hCD31 חיובי לומן) בתוך התקע.