Bioingeniería Humanos redes microvasculares en ratones inmunodeficientes

1. Preparación Hacer EGM-2 medianas (500 ml) Añadir 100 ml de suero fetal bovino (SFB) a 395 ml de medio basal endotelial (EBM-2). Añadir 5 ml de 100x-Glutamina solución de penicilina-estreptomicina (GPS). Agregue todos los 2 EGM-SingleQuots suplementos a excepción de hidrocortisona (es decir, VEGF, hFGF B, R-IGF-1, hEGF, heparina, ácido ascórbico, y GA-1000). Esterilizada por filtración con un filtro de 0,2 micras de poro-vacío de tamaño. Haz medio MSCGM (500 ml) Añadir 5 ml de GPS 100x a 440 ml de medio basal de células madre mesenquimales (MSCBM). Añadir todo el contenido del kit MSCGM SingleQuots. Añadir hFGF-B alícuota del EGM-2 suplementos SingleQuots. Esterilizada por filtración con un filtro de 0,2 micras de poro-vacío de tamaño. Haz medio DMEM (500 ml) Agregar 50 ml de suero fetal bovino (FBS) a 440 ml de 1x altos de glucosa en medio Dulbecco Eagle modificado (DMEM). Añadir 5 ml de GPS 100x. Añadir 5 ml de solución de aminoácidos no esenciales. Esterilizada por filtración con un filtro de 0,2 micras de poro-vacío de tamaño. Producir colágeno / fibronectina solución (3,6 ml; día hizo misma de la inyección) Añadir 0,4 ml de DMEM 10 veces a 150 l de agua destilada H 2 O. Añadir 100 ml de HEPES 1M (25 mM final). Con cuidado, añadir 2,4 ml de colágeno bovino (5 mg / ml, 3 mg / ml final) y mezclar suavemente sobre el hielo. Ajustar el pH a neutro mediante la adición de solución de NaOH 1N (aproximadamente 30 l). Utilice el indicador rojo fenol para evaluar pH neutro; alternativa, utilice papel pH para controlar el pH. Añadir 120 l de fibronectina humana (1 mg / ml, 30 mg / ml final) Añadir 0,4 ml de FBS (10% final) mantener la solución en hielo hasta su uso. Hacer una solución de fibrinógeno (1 ml; día hizo misma de la inyección) Añadir 30 mg de fibrinógeno en polvo a 1 ml de 0.9N NaCl (pH 7,4) solución (30 mg / ml final). Antes de su uso, incubar la solución de fibrinógeno a 37 ° C durante 30 minutos. Mezclar suavemente, sin agitación, antes de su adición al gel de colágeno / fibronectina. Hacer una solución de trombina (200 ml) Añadir una KU de la trombina en polvo a 200 ml de solución salina al 0,9% NaCl normal (50 U / mL). Esterilizada por filtración con un filtro de 0,2 micras de poro-jeringa tamaño y guardar a -20 ° C hasta su uso. Antes de su uso, diluir con solución salina de NaCl al 0,9% normal a una concentración final de 10 U / mL. Haz solución al 1% de gelatina (500 ml) Añadir 5 g de gelatina en polvo y 500 ml de fosfato de Dulbecco (PBS). Autoclave a 121 ° C durante 30 min. Esterilizada por filtración con un filtro de 0,2 micras de poro-vacío de tamaño. Capa de 100 mm placas de cultivo con una solución de revestimiento de 1% de gelatina Agregar 10 ml de solución al 1% de gelatina a cada placa de tejido de 100 mm de la cultura. Incubar las placas a 37 ° C durante 60 min. Antes de su uso, eliminar la solución de gelatina y lavar los platos una vez con PBS. 2. Cultura de cordón umbilical humano derivados de la sangre endoteliales formadoras de colonias-Cells (ECFCs) Este protocolo supone el congelamiento de ECFC están disponibles en el laboratorio antes de este experimento. ECFC puede ser aislada de la fracción de células mononucleares de la sangre del cordón umbilical o la sangre o adultos periféricos como se describió previamente 7. Descongelar un vial de ECFCs (normalmente de 0,5 1×10 6 células en 1 ml de medio de congelación) tomada desde el tanque de nitrógeno de almacenamiento de líquidos y de inmediato diluir su contenido en un tubo cónico de 15 ml que contienen 10 ml de medio DMEM. Giran a 1200 rpm durante 5 min. Quitar el sobrenadante y resuspender el botón celular en 10 ml de agua tibia EGM-2 medio. Añadir los 10 ml de suspensión ECFC en un 1% de gelatina con cubierta de 100 mm de la placa de cultivo de tejidos. Colocar la placa en un incubador humidificado a 37 º C y 5% CO 2. Al día siguiente, suavemente aspire a cabo las células no unidas y medianas empresas, y alimentar las células vinculado con 10 ml de agua dulce EGM-2 medio. Alimentar la placa de cada 2-3 días con EGM-2 medio. Permiten a las células para expandir de manera que la placa está cubierto por una monocapa celular confluente. En la confluencia, la subcultura de las células de la siguiente manera: Aspirar el medio de cultivo y lavar las células con 10 ml de PBS. Quitar PBS y añadir 2 ml de tripsina-EDTA solución a cada placa de 100 mm. Agite suavemente las placas para distribuir uniformemente la solución de tripsina-EDTA. Se incuba a 37 ° C y 5% de CO 2 durante 3-5 minutos. Golpear suavemente la placa para ver las celdas separadas en suspensión bajo un microscopio invertido. Cuando las células totalmente separar, añadir 8 ml de EGM-2 medio y recoger la solución de célulasción en un tubo cónico de 15 ml. Tomar 10 l para contar las células en un hemocitómetro y se calculará la cantidad total de células recolectadas. Placa de las células recubiertas de gelatina al 1% placas de cultivo a una densidad de siembra de 5.000 células / cm 2 con EGM-2 medio. Coloque las placas en la incubadora y darles de comer cada 2-3 días con EGM-2 medio. Repita este procedimiento para los pasajes siguientes. Mantenga un registro del número pasaje como la población de células se expande. ECFCs será utilizado entre los pasos 4-8. 3. La cultura de los huesos humanos derivadas de la médula células madre mesenquimales (MSC) Este protocolo supone el congelamiento de MSC humanos están disponibles en el laboratorio antes de este experimento. MSC se puede aislar de aspirados de médula ósea, como se ha descrito anteriormente 11. Descongelar un vial de MSC (típicamente 0.50-1×10 6 células en 1 ml de medio de congelación) tomada desde el tanque de nitrógeno de almacenamiento de líquidos y de inmediato diluir su contenido en un tubo cónico de 15 ml que contienen 10 ml de medio DMEM. Giran a 1200 rpm durante 5 min. Quitar el sobrenadante y resuspender el botón celular en 10 ml de medio MSCGM caliente. Añadir los 10 ml de la suspensión de MSC en un sin recubrimiento de 100 mm de la placa de cultivo de tejidos. Colocar la placa en un incubador humidificado a 37 º C y 5% CO 2. Al día siguiente, suavemente aspire a cabo las células no unidas y medianas empresas, y alimentar las células vinculado con 10 ml de medio MSCGM fresco. Alimentar la placa de cada 2-3 días con medio MSCGM. Permiten a las células para expandir de manera que la placa alcanza el 80% de monocapa celular confluente. El 80% de confluencia, la subcultura de las células de la siguiente manera: Aspirar el medio de cultivo y lavar las células con 10 ml de PBS. Quitar PBS y añadir 2 ml de tripsina-EDTA solución a cada placa de 100 mm. Agite suavemente las placas para distribuir uniformemente la solución de tripsina-EDTA. Se incuba a 37 ° C y 5% CO2 durante 3-5 minutos. Golpear suavemente la placa para ver las celdas separadas en suspensión bajo un microscopio invertido. Cuando las células totalmente separar, añadir 8 ml de medio MSCGM y recoger la solución de células en un tubo cónico de 15 ml. Tomar 10 l para contar las células en un hemocitómetro y se calculará la cantidad total de células recolectadas. Placa de las células sin recubrimiento en placas de cultivo a una densidad de siembra de 10.000 células / cm 2 utilizando un medio de MSCGM. Coloque las placas en la incubadora y darles de comer cada 2-3 días con medio MSCGM. Repita este procedimiento para los pasajes siguientes. Mantenga un registro del número pasaje como la población de células se expande. MSC se utilizarán entre los pasos 4-8. 4. Resuspensión de las células en la solución de colágeno / fibronectina / fibrinógeno (día 0) Antes del experimento, asegúrese de que hay suficiente ECFCs y MSC en la cultura; 0.8×10 6 ECFCs y 1.2×10 MSC 6 se requerirá para cada implante y el ratón. Aspirar el medio de cada placa de cultivo y lavar las células con 10 ml de PBS. Quitar PBS y añadir 2 ml de tripsina-EDTA solución a cada placa de 100 mm. Agite suavemente las placas para distribuir uniformemente la solución de tripsina-EDTA. Incubar durante 3-5 minutos. Golpear suavemente la placa para ver las celdas separadas en suspensión bajo un microscopio invertido. Cuando las células totalmente separar, añadir 8 ml de medio DMEM y recoger la solución de células en un tubo cónico de 15 ml. Tomar 10 l para contar las células en un hemocitómetro y se calculará la cantidad total de ECFCs y cosechada MSC. Transferencia de 4×10 6 ECFCs (5x 0.8×10 6 células) y 6×10 6 PSM (5x 1.2×10 6 células) para formar un solo de 50 ml tubo cónico. Esta es la cantidad total de células necesarias para cinco implantes individuales y ratones. Centrifugar a 1200 rpm y eliminar el sobrenadante. Suavemente, agregar 100 uL de solución de fibrinógeno a 0,9 ml de solución de colágeno / fibronectina (3 mg / ml la concentración de fibrinógeno final); mantener la mezcla en hielo. Resuspender el botón celular en 1 ml de helado de colágeno / fibronectina / fibrinógeno solución, mezclar las células con mucho cuidado para evitar burbujas. Carga la mezcla en una jeringa estéril de 1 ml, y el lugar de una aguja de calibre 26 con la tapa en la punta de la jeringa. Mantenga la jeringa cargada en hielo hasta la inyección. 5. La inyección en ratones inmunodeficientes Nude (día 0) Todos los experimentos con animales se llevará a cabo con el desnudo de 6 semanas de edad atímicos (nu / nu) ratones. Antes de la inyección, los ratones inmunodeficientes anestesiar colocándolos en una cámara de gas la entrega de isoflurano. Permitir que los ratones inhalan el isoflurano durante unos 2 minutos hasta que estén anestesiados y no responde a una pizca dedo (monitorear su corazón late por la inspección). Para cada ratón, se inyectan 50 l de solución de trombina (10 U / mL) por vía subcutánea en la región dorsal superior con una aguja de calibre 26. <li> En el mismo lugar donde se inyectó la trombina, se inyectan 200 uL de la mezcla de células con una aguja de calibre 26. Gel de colágeno se a 37 ° C y el fibrinógeno se forma de gel de fibrina en la presencia de trombina. Como resultado, el implante debe formar un pequeño pero apreciable, un golpe debajo de la piel. Después de la inyección, coloque el ratón sobre una capa de gasa para el confort y la calidez y observar hasta que se convierten ambulatoria. Luego, después, observar a los ratones al día durante los primeros tres días. 6. La cosecha (día 7) Una semana después de las inyecciones, la eutanasia a los ratones, colocándolos en una cámara de gas comprimido entrega de gas CO 2. Una vez sacrificados, corte la piel cerca del área de la inyección y la cirugía quite el tapón de gel. Fotografías digitales de los tapones de gel obtenido con una escala se recomienda. Coloque los tapones de gel cosechadas en casetes histológicos y profundo que en 10% neutros formalina tamponada durante la noche a temperatura ambiente. Después de la fijación, lavar el 10% de formol tamponado neutro de distancia con H 2 O destilada y colocar los casetes histológicos a 4 ° C en PBS hasta que la evaluación histológica. 7. Evaluación: Histología (H & E) e inmunohistoquímica (hCD31) Para la evaluación histológica, los implantes se incluyeron en parafina y se seccionaron (7 micras de espesor secciones) utilizando los procedimientos histológicos. Cuantificar la densidad de los microvasos de la evaluación de Hematoxilina y Eosina (H & E) manchadas secciones tomadas de la parte media de los implantes. Protocolos estándar para la tinción H & E se puede encontrar en otros lugares. Microvasos se pueden identificar las estructuras luminal contiene glóbulos rojos. Informe microvasos densidad como el número promedio de glóbulos rojos llenos de microvasos de los campos analizados y se expresa como vasos / mm 2. Para demostrar la naturaleza humana de los vasos microvascular, las secciones del implante debe ser recuperada mediante inmunohistoquímica manchadas con CD31 humano específico (hCD31) anticuerpos por medio de protocolos estándar de tinción. Se recomienda utilizar el ratón monoclonal anti-CD31 humano de anticuerpos de DakoCytomation (Clon JC70A;. Cat # M0823) a una dilución 1:100. La especificidad de este anticuerpo humano ha sido confirmado por la reacción negativa obtenida con una diversidad de secciones de tejido de ratón que se tiñeron en paralelo 7,11. Es de destacar que los vasos sanguíneos del ratón se ven a menudo en el interior de los implantes (especialmente alrededor de la frontera), pero los vasos del ratón no se tiñen positivamente con este anticuerpo. Además, la presencia de MSC humanos pueden ser detectados por tinción inmunohistoquímica con anticuerpos específicos para humanos contra CD90 o α-actina de músculo liso (α-SMA). MSC humanos se encuentran tanto en la región perivascular de los vasos sanguíneos recién formados y intersticial en todo el implante 11. 8. Resultados representante Figura 1. Aspecto típico de las culturas y ECFC MSC. Microfotografías de contraste de fase que muestra el aspecto típico de ECFCs y MSC en la cultura. (A) monocapas de derivados de la sangre del cordón ECFCs mostrando la característica adoquines morfología de las células endoteliales. (B) huesos humanos derivadas de la médula MSC mostrando una morfología forma de huso. Escalador bares, 200 um. Figura 2. Aparición de tapones explantados en el día 7. Derivados de la sangre de cordón umbilical humano ECFCs y médula ósea procedentes de MSC fueron incorporados en el colágeno / fibronectina / gel de fibrina y se implantaron subcutáneamente en ratones desnudos como se describe en el texto. (A) Después de 7 días, una vez que el ratón se ha sacrificado, corte la piel cerca del área de la inyección y exponer el tapón de células / gel moviendo de un tirón en la piel. (B) Aparición de la clavija de la extirpación quirúrgica del ratón y antes de la fijación en formol. El color rojo del implante es una indicación de la vascularización. Figura 3. Identificación histológica de la red vascular en los enchufes explantados. Hematoxilina y eosina (H & E) secciones teñidas tomado de la parte central de los tapones explantados. (A) bajo aumento (10x) Microfotografía que muestra el implante (marcado por una línea amarilla discontinua) en el contexto de los tejidos del huésped circundante (es decir, el tejido adiposo y el músculo esquelético). (B) de gran aumento (40x) Micrografía mostrando múltiples microvasos (punta de flecha amarilla que apunta a algunos de ellos) en el interior del enchufe y microvasculatura pueden ser identificados como estructuras luminal contienen los glóbulos rojos. Figura 4. Identificación inmunohistoquímica de los derechos humanoslúmenes. inmunohistoquímica las secciones teñidas tomado de la parte central de los tapones explantados. La tinción se llevó a cabo utilizando un ratón monoclonal anti-CD31 humano (hCD31) de anticuerpos de DakoCytomation (Clon JC70A;. Cat # M0823) a una dilución 1:100; núcleos celulares fueron contrastados con hematoxilina. (A) bajo aumento (10x) Microfotografía que muestra el implante (delimitada por una línea discontinua negro) en el contexto de los tejidos circundantes de acogida. Humano específico, CD31-positivo microvasos se tiñen de color marrón (tinción con peroxidasa). (B) de gran aumento (40x) Micrografía mostrando múltiples microvasos humanos (negro flecha que apunta en algún lúmenes hCD31-positivo) dentro del enchufe.