Bioengineering humane mikrovaskuläre Networks in immundefizienten Mäusen

1. Vorbereitung Machen EGM-2 Medium (500 mL) Add 100 ml fötales Rinderserum (FBS) auf 395 ml Endothelial Basal Medium (EBM-2). 5 ml 100x Glutamin-Penicillin-Streptomycin-Lösung (GPS). Fügen Sie alle EGM-2 SingleQuots Ergänzungen außer Hydrocortison (dh, VEGF, hFGF-B, R-IGF-1, hEGF, Heparin, Ascorbinsäure, und GA-1000). Filter sterilisiert mit einem 0,2-um Porengröße Vakuum-Filter. Machen MSCGM Medium (500 mL) 5 ml 100x GPS bis 440 ml mesenchymalen Stammzellen Basal Medium (MSCBM). Fügen Sie alle Inhalte der MSCGM SingleQuots Kit. Add hFGF-B Aliquot von EGM-2 SingleQuots ergänzt. Filter sterilisiert mit einem 0,2-um Porengröße Vakuum-Filter. Machen DMEM-Medium (500 mL) 50 ml fötales Rinderserum (FBS) auf 440 ml 1x hohen Glukose Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM). 5 ml 100x GPS. 5 ml nicht essentielle Aminosäure-Lösung. Filter sterilisiert mit einem 0,2-um Porengröße Vakuum-Filter. Machen Kollagen / Fibronektin-Lösung (3,6 mL; aus am selben Tag nach der Injektion) Fügen Sie 0,4 ml 10x DMEM auf 150 ul destilliertem H 2 O. 100 l 1M HEPES (25 mM final). Vorsichtig fügen 2,4 ml Rinder-Kollagen (5 mg / mL Lager 3 mg / mL endg.) und vorsichtig mischen auf dem Eis. Stellen Sie den pH-Wert auf neutral durch Zugabe von 1N NaOH-Lösung (ca. 30 mL). Verwenden Sie Phenolrot-Indikator auf einen neutralen pH bewerten; Alternative verwenden Sie pH-Testpapier auf pH-Monitor. Add 120 ul humanem Fibronectin (1 mg / mL Lager 30 pg / mL endg.) Fügen Sie 0,4 ml FBS (10% endg.) halten Lösung auf Eis bis zum Gebrauch. Machen Fibrinogen-Lösung (1 mL, machte am selben Tag nach der Injektion) Zugabe von 30 mg in Pulverform Fibrinogen zu 1 ml 0,9 N NaCl (pH 7,4)-Lösung (30 mg / mL endg.). Vor dem Gebrauch inkubieren Fibrinogen-Lösung bei 37 ° C für 30 Minuten. Vorsichtig mischen, ohne Verwirbelungen, vor der Zugabe zu den Kollagen / Fibronektin Gel. Machen Thrombin-Lösung (200 mL) Add 1 KU von pulverförmigen Thrombin zu 200 ml 0,9% NaCl Kochsalzlösung (50 U / mL). Filter sterilisiert mit einem 0,2-um Porengröße Spritze Filter und bei -20 ° C bis zur Verwendung. Vor dem Gebrauch verdünnt mit 0,9% NaCl normaler Kochsalzlösung auf eine Endkonzentration von 10 U / mL. Machen Sie 1% Gelatine-Lösung (500 mL) 5 g pulverisierte Gelatine 500 ml Dulbecco phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS). Bei 121 ° C für 30 min. Filter sterilisiert mit einem 0,2-um Porengröße Vakuum-Filter. Coat 100-mm-Zellkulturplatten mit 1% Gelatine Beschichtungslösung Fügen Sie 10 ml 1% Gelatine-Lösung in jede 100-mm Gewebekulturplatte. Die Platten bei 37 ° C für 60 min. Vor dem Gebrauch entfernen Sie die Gelatine-Lösung und waschen Sie die Platten einmal mit PBS. 2. Kultur der Menschenrechte Cord Endothelial Colony-Forming Cells (ECFCs) Blut-Derived Dieses Protokoll übernimmt gefrorene Fläschchen ECFC stehen im Labor vor diesem Experiment. ECFC können aus den mononukleären Zellfraktion entweder Nabelschnurblut oder Erwachsener peripheren Blut als vorher 7 beschrieben isoliert werden. Tauwetter ein Fläschchen ECFCs (typischerweise 0,5-1×10 6 Zellen in 1 ml des Einfrierens Medien) aus dem flüssigen Stickstoff Speicher entnommen und sofort verdünnen deren Inhalt in einem 15-mL konische Röhrchen mit 10 ml DMEM-Medium. Spin bei 1200 rpm für 5 min. Überstand entfernen und Zellpellet in 10 ml warmes EGM-2 Medium. Fügen Sie die 10 ml ECFC Aufhängung in einer 1% Gelatine beschichtete 100-mm Gewebekulturplatte. Die Platte wird in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C und 5% CO 2. Am nächsten Tag vorsichtig aspirieren aus ungebundenen Zellen und Medium, und Futtermitteln gebundenen Zellen mit 10 ml frisches EGM-2 Medium. Vorschub der Platte alle 2-3 Tage mit EGM-2 Medium. Lassen Zellen zu erweitern, so dass die Platte durch eine konfluente Monolayer zellulären bedeckt ist. Bei Konfluenz Subkultur der Zellen wie folgt: Absaugen aus dem Kulturmedium und die Zellen mit 10 ml PBS. Entfernen PBS und 2 mL Trypsin-EDTA-Lösung in jede 100-mm-Platte. Schütteln Sie die Platten zur gleichmäßigen Verteilung der Trypsin-EDTA-Lösung. Bei 37 ° C und 5% CO 2 für 3-5 Minuten. Klopfen Sie leicht die Platte an den abgelösten Zellen in Suspension unter einem inversen Mikroskop zu sehen. Wenn die Zellen vollständig zu lösen, 8 ml EGM-2 Medium und sammeln Sie die Zelle Lösungenbindung an den 15-mL konischen Rohr. Nehmen Sie sich 10 ul der Zellen in einer Zählkammer zählen und erarbeiten die Gesamtzahl der Zellen geerntet. Platte die Zellen in 1% Gelatine beschichtete Zellkulturplatten mit einer Aussaatdichte von 5.000 Zellen / cm 2 mit EGM-2 Medium. Legen Sie die Platten in den Inkubator und füttern sie alle 2-3 Tage mit EGM-2 Medium. Wiederholen Sie diesen Vorgang für nachfolgende Passagen. Verfolgen Sie die Passage-Nummer als der Zellpopulation wird erweitert. ECFCs wird zwischen den Kanälen 4-8 eingesetzt werden. 3. Kultur der Menschenrechte Knochenmark abgeleiteten mesenchymalen Stammzellen (MSCs) Dieses Protokoll übernimmt gefrorene Fläschchen des menschlichen MSC stehen im Labor vor diesem Experiment. MSC isoliert aus Knochenmark saugt wie bisher 11 beschrieben. Tauwetter ein Fläschchen von MSCs (typischerweise 0.50-1×10 6 Zellen in 1 mL Einfrieren Medien) aus dem flüssigen Stickstoff Speicher entnommen und sofort verdünnen deren Inhalt in einem 15-mL konische Röhrchen mit 10 ml DMEM-Medium. Spin bei 1200 rpm für 5 min. Überstand entfernen und Zellpellet in 10 ml warmes MSCGM Medium. Fügen Sie die 10 ml MSC Suspension in eine unbeschichtete 100-mm Gewebekulturplatte. Die Platte wird in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C und 5% CO 2. Am nächsten Tag vorsichtig aspirieren aus ungebundenen Zellen und Medium, und Futtermitteln gebundenen Zellen mit 10 ml frisch MSCGM Medium. Vorschub der Platte alle 2-3 Tage mit MSCGM Medium. Lassen Zellen zu erweitern, so dass die Platte 80% konfluenten Zellen Monoschicht erreicht. Bei 80% Konfluenz, Subkultur der Zellen wie folgt: Absaugen aus dem Kulturmedium und die Zellen mit 10 ml PBS. Entfernen PBS und 2 mL Trypsin-EDTA-Lösung in jede 100-mm-Platte. Schütteln Sie die Platten zur gleichmäßigen Verteilung der Trypsin-EDTA-Lösung. Bei 37 ° C und 5% CO2 für 3-5 Minuten. Klopfen Sie leicht die Platte an den abgelösten Zellen in Suspension unter einem inversen Mikroskop zu sehen. Wenn die Zellen vollständig zu lösen, 8 ml MSCGM Medium und sammeln Sie die Zell-Lösung in einen 15-mL konischen Rohr. Nehmen Sie sich 10 ul der Zellen in einer Zählkammer zählen und erarbeiten die Gesamtzahl der Zellen geerntet. Platte die Zellen in unbeschichteten Zellkulturplatten mit einer Aussaatdichte von 10.000 Zellen / cm 2 mit MSCGM Medium. Legen Sie die Platten in den Inkubator und füttern sie alle 2-3 Tage mit MSCGM Medium. Wiederholen Sie diesen Vorgang für nachfolgende Passagen. Verfolgen Sie die Passage-Nummer als der Zellpopulation wird erweitert. MSCs werden zwischen den Kanälen 4-8 eingesetzt werden. 4. Resuspension der Zellen in Collagen / Fibronectin / Fibrinogen-Lösung (Tag 0) Vor dem Versuch, stellen Sie sicher, es gibt genug ECFCs und MSCs in Kultur; 0.8×10 6 ECFCs und 1.2×10 6 MSCs wird für jedes Implantat und Maus erforderlich. Saugen Sie sich das Medium der jede Kultur Platte und waschen Sie die Zellen mit 10 ml PBS. Entfernen PBS und 2 mL Trypsin-EDTA-Lösung in jede 100-mm-Platte. Schütteln Sie die Platten zur gleichmäßigen Verteilung der Trypsin-EDTA-Lösung. Inkubieren für 3-5 Minuten. Klopfen Sie leicht die Platte an den abgelösten Zellen in Suspension unter einem inversen Mikroskop zu sehen. Wenn die Zellen vollständig zu lösen, 8 ml DMEM-Medium und sammeln Sie die Zell-Lösung in einen 15-mL konischen Rohr. Nehmen Sie sich 10 ul der Zellen in einer Zählkammer zählen und erarbeiten die Gesamtzahl der ECFCs und MSCs geerntet. Transfer-4×10 6 ECFCs (5x 0.8×10 6 Zellen) und 6×10 6 PLM (5x 1.2×10 6 Zellen) in einem einzigen 50-mL konischen Rohr. Dies ist der Gesamtbetrag der Zellen für die fünf einzelnen Implantate und Mäuse benötigt. Zentrifugation bei 1200 rpm und Überstand. Sanft, mit 100 uL der Fibrinogen-Lösung auf 0,9 ml Kollagen / Fibronektin-Lösung (3 mg / mL letzten Fibrinogenkonzentration); halten Sie die Mischung auf Eis. Zellpellet auf 1 mL eiskaltem Kollagen / Fibronektin / Fibrinogen-Lösung, mischen Sie die Zellen sehr vorsichtig, um Blasen zu vermeiden. Laden Sie die Mischung in eine 1-mL sterile Spritze, und legen Sie eine 26-Gauge-Nadel mit seiner Kappe auf der Spitze der Spritze. Halten Sie die geladene Spritze auf Eis, bis Injektion. 5. Die Injektion in Immundefiziente Nacktmaus (Tag 0) Alle Tierversuche werden mit 6-Wochen alten athymischer (nu / nu) Mäusen durchgeführt werden. Vor der Injektion, betäuben die immundefizienten Mäusen, indem sie sie in eine Gaskammer liefert Isofluran. Lassen Sie die Maus auf die Isofluran für ca. 2 Minuten inhalieren, bis sie betäubt und reagiert nicht mehr bis zu den Zehen Prise (Überwachung ihrer Herzschläge durch Inspektion) sind. Für jede Maus injizieren 50 ul Thrombin-Lösung (10 U / ml) subkutan in den oberen dorsalen Bereich mit einem 26-Gauge-Nadel. <li> In der gleichen Stelle, wo Thrombin injiziert wurde, zu injizieren 200 ul der Zelle Mischung unter Verwendung eines 26-G-Nadel. Collagen wird Gel bei 37 ° C und Fibrinogen wird Fibrin-Gel in Gegenwart von Thrombin zu bilden. Als Ergebnis sollte das Implantat bilden eine kleine, aber spürbare, Bump unter die Haut. Nach der Injektion statt der Mäuse auf einer Schicht aus Gaze für Komfort und Wärme und beobachten sie, bis sie ambulant zu werden. Dann nach, beobachten die Mäuse täglich für die ersten drei Tage. 6. Harvesting (Tag 7) Eine Woche nach der Injektion, euthanize die Mäuse, indem sie sie in eine Gaskammer liefert komprimierte CO 2-Gas. Sobald eingeschläfert, aufgeschnitten die Haut in der Nähe der Bereich der Injektions-und chirurgisch zu entfernen das Gel-Stecker. Digitale Fotos der abgerufenen Gel-Stecker mit einer Skala wird empfohlen. Legen Sie die geernteten Gel Stecker in histologischen Kassette und tief sie in 10% neutral gepuffertem Formalin über Nacht bei Raumtemperatur. Nach der Fixierung, waschen Sie die 10% neutral gepuffertem Formalin weg mit destilliertem H 2 O und Ort der histologischen Kassetten bei 4 ° C in PBS bis histologische Beurteilung. 7. Evaluation: Histologie (H & E) und Immunhistochemie (hCD31) Zur histologischen Auswertung werden die Implantate in Paraffin und geschnitten (7 Mikrometer dicke Abschnitte) mit Standard-histologische Verfahren eingebettet. Quantify microvessel Dichte durch Auswertung von Hämatoxilin und Eosin (H & E) gefärbten Schnitten aus dem mittleren Teil der Implantate übernommen. Standard-Protokolle für die H & E Färbung kann an anderer Stelle gefunden werden. Mikrogefäßen kann als luminalen Strukturen mit roten Blutkörperchen identifiziert werden. Bericht Mikrogefäßen Dichte wie die durchschnittliche Zahl der roten Blutkörperchen gefüllten Mikrogefäßen aus den Bereichen analysiert und Gefäße / mm 2 angegeben. Zur Demonstration der menschlichen Natur der mikrovaskulären Gefäße, Abschnitte der abgerufenen Implantat sollte immunhistochemisch mit einem human-spezifischen CD31 (hCD31) Antikörper unter Verwendung von Standard Färbeprotokollen gefärbt werden. Wir empfehlen die Verwendung des monoklonalen Maus-Anti-Human-CD31-Antikörper aus DakoCytomation (Clone JC70A;. Cat # M0823) in einer 1:100-Verdünnung. Der menschliche Spezifität dieses Antikörpers wurde durch die negative Reaktion mit einer Vielfalt von Maus Gewebeschnitten, die in parallel 7,11 gefärbt wurden gewonnen bestätigt worden. Zu beachten ist, sind Maus Blutgefäße oft im Inneren der Implantate zu sehen (besonders um die Grenze), sondern mit der Maus Schiffe keine Flecken mit diesem Antikörper positiv. Darüber hinaus kann das Vorhandensein von menschlichen MSC durch immunhistochemische Färbung mit human-spezifische Antikörper gegen CD90 bzw. α-smooth muscle actin (α-SMA) nachgewiesen werden. Menschliche MSC sind sowohl in den perivaskulären Region neu gebildete Blutgefäße und interstitiell in das Implantat 11 befindet sich gefunden. 8. Repräsentative Ergebnisse Abbildung 1. Typisches Erscheinungsbild ECFC und MSC Kulturen. Phasenkontrast-Aufnahmen zeigt die typische Erscheinungsbild der ECFCs und MSCs in Kultur. (A) Monolayer von Nabelschnurblut gewonnenen ECFCs Darstellung der charakteristischen Kopfsteinpflaster Morphologie der Endothelzellen. (B) Human Knochenmark abgeleiteten MSCs Anzeige einer Spindelform Morphologie. Scaler Bars, 200 um. Abbildung 2. Aussehen der explantierten Stecker am Tag 7. Humanem Nabelschnurblut gewonnenen ECFCs und Knochenmark abgeleiteten MSCs wurden in Kollagen / Fibronektin / Fibrin-Gel eingebettet und subkutan in Nacktmäuse implantiert, wie im Text beschrieben. (A) Nach 7 Tagen, sobald die Maus wurde eingeschläfert, aufgeschnitten die Haut in der Nähe der Bereich der Injektionsstelle und setzen die Zelle / Gelpfropfen durch Umklappen der Haut. (B) Aussehen des Steckers chirurgisch aus der Maus und vor Formalinfixierung entfernt. Die rote Farbe des Implantats ist ein Indiz für Vaskularisation. Abbildung 3. Histologische Identifizierung von Gefäßnetz in explantierten Stecker. Hämatoxilin und Eosin (H & E) gefärbten Schnitten aus dem mittleren Teil der explantierten Stecker genommen. (A) geringer Vergrößerung (10x) Aufnahme zeigt die Implantat (gekennzeichnet durch ein gelbes gestrichelte Linie) im Kontext der umgebenden Wirtsgewebe (dh, Fettgewebe und Skelettmuskulatur). (B) Starke Vergrößerung (40x) Aufnahme Anzeige mehrerer Mikrogefäßen (gelbe Pfeilspitze zeigt auf einige von ihnen) im Stecker; Mikrogefäßen kann als luminalen Strukturen mit roten Blutkörperchen identifiziert werden. Abbildung 4. Immunhistochemische Identifizierung von menschlichenLumen. Immunhistochemisch gefärbten Schnitten aus dem mittleren Teil der explantierten Stecker genommen. Bei einer Verdünnung 1:100; Färbung wurde mit einem monoklonalen Maus-Anti-Human-CD31 (hCD31) Antikörper aus DakoCytomation (. Cat # M0823 Clone JC70A); durchgeführt Zellkerne wurden mit Hämatoxilin gegengefärbt. (A) geringer Vergrößerung (10x) Aufnahme zeigt die Implantat (abgegrenzt durch eine schwarze gestrichelte Linie) im Kontext der umgebenden Wirtsgewebe. Die spezifischen menschlichen, CD31-positive Mikrogefäßen sind in braun (Peroxidase-Färbung) gefärbt. (B) Starke Vergrößerung (40x) Aufnahme Anzeige mehrerer Menschen Mikrogefäßen (schwarz Pfeilspitze an einigen hCD31-positive Lumen) im Stecker.