Bioengenharia Humanos Networks microvascular em camundongos imunodeficientes

1. Preparação Faça EGM-2 médias (500 mL) Adicionar 100 mL de soro fetal bovino (FBS) a 395 mL de meio basal endotelial (EBM-2). Adicionar 5 mL de solução-Glutamina penicilina-estreptomicina 100x (GPS). Adicione todos os suplementos EGM-2 SingleQuots exceto hidrocortisona (isto é, VEGF, hFGF-B, R-IGF-1, hEGF, heparina, ácido ascórbico, e GA-1000). Filtro esterilizados com um filtro de vácuo 0,2 mícrons tamanho dos poros. Faça MSCGM médio (500 mL) Adicionar 5 mL de GPS 100x a 440 mL de meio basal mesenquimais Stem Cell (MSCBM). Adicionar todo o conteúdo do kit SingleQuots MSCGM. Adicionar hFGF-B alíquota de suplementos EGM-2 SingleQuots. Filtro esterilizados com um filtro de vácuo 0,2 mícrons tamanho dos poros. Faça DMEM (500 mL) Adicionar 50 mL de soro fetal bovino (FBS) a 440 mL de glicose alta 1x Dulbecco Modificado Águia Medium (DMEM). Adicionar 5 mL de GPS 100x. Adicionar 5 mL de solução de aminoácido não essencial. Filtro esterilizados com um filtro de vácuo 0,2 mícrons tamanho dos poros. Faça colágeno / fibronectina solução (3,6 mL; feitas no mesmo dia da injecção) Adicionar 0,4 mL de DMEM 10x a 150 mL de água destilada H 2 O. Adicionar 100 mL de HEPES 1M (25 mM final). Cuidadosamente, adicione 2,4 mL de colágeno bovino (5 ações mg / mL; 3 mg / mL final) e misture delicadamente no gelo. Ajustar o pH a neutralidade por adição de solução de NaOH 1N (aproximadamente 30 mL). Use indicador vermelho de fenol para avaliar pH neutro; alternativa, use papel de teste para monitorar pH pH. Adicionar 120 mL de fibronectina humana (1 estoque mg / mL, 30 mcg / mL final) Adicionar 0,4 mL de FBS (10% final) manter solução em gelo até o uso. Fazer a solução de fibrinogênio (1 mL; feitas no mesmo dia da injecção) Adicionar 30 mg de fibrinogênio em pó para 1 mL de NaCl 0.9N (pH 7,4) solução (30 mg / mL final). Antes do uso, incubar a solução de fibrinogênio, a 37 ° C por 30 minutos. Misture delicadamente, sem vortex, antes de sua adição ao gel de colágeno / fibronectina. Faça trombina solução (200 mL) Adicionar um KU de trombina em pó para 200 mL de solução salina NaCl 0,9% normal (50 U / mL). Filtro esterilizados com um filtro de seringa de 0,2 mícrons tamanho dos poros e armazenar a -20 ° C até o uso. Antes do uso, diluir com 0,9% NaCl normal para uma concentração final de 10 U / mL. Fazer 1% de solução de gelatina (500 ml) Adicionar 5 g de gelatina em pó para 500 mL de fosfato de solução salina tamponada Dulbecco (PBS). Autoclavado a 121 ° C por 30 min. Filtro esterilizados com um filtro de vácuo 0,2 mícrons tamanho dos poros. Casaco de 100 milímetros de tecido placas de cultura com solução de revestimento de 1% de gelatina Adicionar 10 mL de solução de gelatina 1% a cada placa de cultura de 100 mm de tecido. Incubar as placas a 37 ° C por 60 min. Antes do uso, remover a solução de gelatina e lavar os pratos uma vez com PBS. 2. Cultura de Cabo Humanos derivados do sangue endotelial Colony-Forming Cells (ECFCs) Este protocolo assume frascos congelados de ECFC estão disponíveis no laboratório antes desta experiência. ECFC pode ser isolado a partir da fração de células mononucleares de qualquer sangue do cordão umbilical ou sangue periférico de adultos, como descrito anteriormente 7. Frasco de descongelar um dos ECFCs (tipicamente 0.5-1×10 6 células em 1 mL de meios de congelamento) retirado do tanque de armazenamento de nitrogênio líquido e imediatamente diluir seu conteúdo em um tubo de 15 mL cônico contendo 10 mL de meio DMEM. Giram a 1200 rpm por 5 min. Remover o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em 10 mL de meio de EGM-2 quente. Adicionar a 10 mL de suspensão ECFC em um 1% de gelatina revestidos de 100 mm placa de cultura de tecidos. Coloque a placa em uma incubadora umidificada a 37 ° C e 5% CO 2. No dia seguinte, aspirar cuidadosamente as células não ligado e médias empresas, e alimentam as células preso com 10 mL de meio de EGM-2 fresca. Alimentar a placa a cada 2-3 dias, com EGM-2 médio. Permitem que as células se expandir de tal forma que a placa é coberta por uma monocamada confluente celular. Na confluência, as células subcultura da seguinte forma: Aspirar o meio de cultura e lavar as células com 10 mL de PBS. Remover PBS e adicionar 2 mL de tripsina-EDTA solução para cada placa de 100 mm. Agite levemente o prato para distribuir uniformemente a solução de tripsina-EDTA. Incubar a 37 ° C e 5% CO 2 por 3-5 minutos. Bata suavemente na placa para ver as células destacadas em suspensão sob um microscópio invertido. Quando as células completamente destacar, adicionar 8 ml de EGM-2 médio e recolher o solu celularção em um tubo de 15 mL cônico. Exame de 10 mL para contar as células em um hemocitómetro e trabalhar o número total de células colhidas. Placa as células em 1% de gelatina revestido placas de cultura de tecidos com uma densidade de semeadura de 5.000 células / cm 2, utilizando-2 EGM médio. Coloque as placas na incubadora e alimentá-los a cada 2-3 dias, com EGM-2 médio. Repita este procedimento para passagens subseqüentes. Manter o controle do número de passagem como a população de células é expandido. ECFCs será usado entre as passagens 4-8. 3. Cultura de medula óssea humana Derivados Células-Tronco Mesenquimais (MSCs) Este protocolo assume frascos congelados da MSC humano estão disponíveis no laboratório antes desta experiência. MSC pode ser isolada de aspirados de medula óssea, como descrito anteriormente 11. Frasco de descongelar um dos MSCs (tipicamente 0,50 1×10 6 células em 1 mL de mídia congelação) retirado do tanque de armazenamento de nitrogênio líquido e imediatamente diluir seu conteúdo em um tubo de 15 mL cônico contendo 10 mL de meio DMEM. Giram a 1200 rpm por 5 min. Remover o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em 10 mL de meio MSCGM quente. Adicionar a 10 mL de suspensão MSC em uma placa de cultura não revestido de 100 mm de tecido. Coloque a placa em uma incubadora umidificada a 37 ° C e 5% CO 2. No dia seguinte, aspirar cuidadosamente as células não ligado e médias empresas, e alimentam as células preso com 10 mL de meio de MSCGM fresco. Alimentar a placa a cada 2-3 dias, com média MSCGM. Permitem que as células se expandir de tal forma que a placa chega a 80% da monocamada celular confluente. Na confluência de 80%, subcultura as células da seguinte forma: Aspirar o meio de cultura e lavar as células com 10 mL de PBS. Remover PBS e adicionar 2 mL de tripsina-EDTA solução para cada placa de 100 mm. Agite levemente o prato para distribuir uniformemente a solução de tripsina-EDTA. Incubar a 37 ° C e 5% CO2 por 3-5 minutos. Bata suavemente na placa para ver as células destacadas em suspensão sob um microscópio invertido. Quando as células completamente destacar, adicionar 8 ml de meio de MSCGM e recolher a solução de células em um tubo de 15 mL cônico. Exame de 10 mL para contar as células em um hemocitómetro e trabalhar o número total de células colhidas. Placa de células em placas de cultura de tecidos revestidos com uma densidade de semeadura de 10.000 células / cm 2, utilizando meio MSCGM. Coloque as placas na incubadora e alimentá-los a cada 2-3 dias, com média MSCGM. Repita este procedimento para passagens subseqüentes. Manter o controle do número de passagem como a população de células é expandido. MSCs será usado entre as passagens 4-8. 4. Ressuspensão de células em Colágeno fibronectina / / Fibrinogênio Solution (Dia 0) Antes do experimento, verifique se não ECFCs suficiente e MSCs em cultura; 0.8×10 6 ECFCs e 1.2×10 6 MSCs serão necessários para cada implante e mouse. Aspirar o meio de cada placa de cultura e lavar as células com 10 mL de PBS. Remover PBS e adicionar 2 mL de tripsina-EDTA solução para cada placa de 100 mm. Agite levemente o prato para distribuir uniformemente a solução de tripsina-EDTA. Incubar por 3-5 minutos. Bata suavemente na placa para ver as células destacadas em suspensão sob um microscópio invertido. Quando as células completamente destacar, adicionar 8 ml de meio DMEM e recolher a solução de células em um tubo de 15 mL cônico. Exame de 10 mL para contar as células em um hemocitómetro e elaborar o número total de ECFCs e colhida MSCs. Transferência de 4×10 6 ECFCs (5x 0.8×10 6 células) e 6×10 6 PPM (5x 1.2×10 6 células) juntos em um tubo de 50 mL única cônica. Esta é a quantidade total de células necessárias para cinco implantes individuais e camundongos. Centrifugar a 1200 rpm e remover o sobrenadante. Delicadamente, adicionar 100 uL de solução de fibrinogênio a 0,9 mL de colágeno / fibronectina solução (3 mg / mL concentração de fibrinogênio final); manter a mistura sobre o gelo. Ressuspender o pellet celular em 1 mL de solução de colágeno gelo fibronectina / / fibrinogênio frio, misture as células muito cuidado para evitar bolhas. Carga a mistura em uma seringa de 1 mL estéril, e colocar uma agulha de calibre 26 com a tampa na ponta da seringa. Manter a seringa carregada em gelo até injeção. 5. Injecção rato Nude imunodeficientes (Dia 0) Todos os experimentos com animais será realizada com seis semanas de idade atímicos nude (nu / nu) camundongos. Antes da injeção, anestesiar os ratos imunodeficientes, colocando-os em uma câmara de gás isoflurano entrega. Permitir que os ratos para inalar o isoflurano por aproximadamente 2 minutos até que eles são anestesiados e sem resposta para beliscar toe (monitor bate o seu coração por inspeção). Para cada rato, injetar 50 mL de solução de trombina (10 U / mL) por via subcutânea na região dorsal superior usando uma agulha de 26 gauge. <li> No mesmo local onde foi injetada trombina, injetar 200 mL da mistura de células usando uma agulha de 26 gauge. Colágeno vai gel a 37 ° C e fibrinogênio irá formar gel de fibrina, na presença de trombina. Como resultado, o implante deve formar uma pequena, mas significativa, bump sob a pele. Após a injeção, coloque o mouse sobre uma camada de gaze para o conforto e calor e observá-los até que se tornem ambulatorial. Então, depois, observe os ratos diariamente durante os primeiros três dias. 6. Colheita (dia 7) Uma semana após as injeções, eutanásia os ratos, colocando-os em uma câmara de gás comprimido CO 2 fornecendo gás. Uma vez sacrificados, cortado a pele perto da área da injeção e remover cirurgicamente a ficha de gel. Fotografias digitais dos plugues gel obtido com uma escala são aconselhados. Coloque as velas de gel colhidas em cassete histológicos e profunda-los em 10% formalina tamponada neutra durante a noite a temperatura ambiente. Após a fixação, lave a 10% neutro tamponado acabar com H 2 O destilada e coloque a cassetes histológicos a 4 ° C em PBS avaliação até histológica. 7. Avaliação: Histologia (H & E) e imunohistoquímica (hCD31) Para avaliação histológica, os implantes são embebidos em parafina e seccionados (7 m de espessura seções), utilizando procedimentos padrão histológico. Quantificar a densidade microvascular pela avaliação dos cortes (H & E) Hematoxilina e eosina foram retiradas da parte média dos implantes. Protocolos padrão para coloração H & E podem ser encontrados em outros lugares. Microvasos pode ser identificado como estruturas lumenal contendo células vermelhas do sangue. Relatório densidade de microvasos como o número médio de glóbulos vermelhos cheios de microvasos dos campos analisados ​​e expressos como vasos / mm 2. Para demonstrar a natureza humana dos vasos microvascular, as seções do implante deve ser recuperada imunohistoquímica marcadas com um CD31 humano específico (hCD31) anticorpos, por meio de protocolos de coloração padrão. Recomendamos o uso do anticorpo monoclonal de rato anti-CD31 humano de anticorpos DakoCytomation (Clone JC70A;. Cat # M0823) em uma diluição de 1:100. A especificidade deste anticorpo humano foi confirmado pela reação negativa obtida com uma diversidade de seções do mouse tecido que foram coradas em 7,11 paralelo. De nota, os vasos sanguíneos do mouse são muitas vezes vistos no interior do implante (especialmente em torno da fronteira), mas os navios do mouse não mancha positiva com este anticorpo. Além disso, a presença de MSC humana pode ser detectado por coloração imuno-histoquímica com anticorpos específicos humana contra CD90 ou α-actina de músculo liso (α-SMA). MSC humanos são encontrados tanto na região perivascular dos vasos recém-formados no sangue e intersticialmente localizados em todo o implante 11. 8. Resultados representante Figura 1. Aparência típica de ECFC e culturas MSC. Micrografias de contraste de fase exibindo a aparência típica de ECFCs e MSCs em cultura. (A) monocamada confluente de sangue do cordão umbilical derivados ECFCs mostrando a morfologia calçada característica das células endoteliais. (B) de medula óssea humana derivada MSCs exibindo uma morfologia forma fuso. Bares Scaler, 200 um. Figura 2. Aparecimento de plugues explantado no dia 7. Derivados do sangue do cordão umbilical e ECFCs derivadas da medula óssea MSCs foram incluídos em colágeno / fibronectina / fibrina gel e implantado por via subcutânea em camundongos nus, como descrito no texto. (A) Após 7 dias, uma vez que o mouse tem sido sacrificada, cortado a pele perto da área da injeção e expor o plugue de celular / gel lançando a pele. (B) Aspecto da ficha cirurgicamente removido do mouse e antes da fixação de formol. A cor vermelha do implante é uma indicação de vascularização. Figura 3. Identificação histológica da rede vascular em plugs explantado. Hematoxilina e Eosina (H & E) cortes corados retirado da parte central da plugs explantado. (A) A baixa ampliação micrografia (10x) mostrando o implante (marcado por uma linha amarela tracejada) no contexto dos tecidos do hospedeiro circundante (ie, tecido adiposo e músculo esquelético). (B) grande aumento (40x) micrografia mostrando microvasos múltiplos (amarelo seta apontando para alguns deles) dentro do plug; microvasos pode ser identificado como estruturas lumenal contendo células vermelhas do sangue. Figura 4. Identificação imuno-histoquímica dos direitos humanoslumens. imunohistoquímica cortes corados retirado da parte central da plugs explantado. Coloração foi realizada utilizando um anticorpo monoclonal anti-CD31 humano de anticorpos (hCD31) de DakoCytomation (Clone JC70A;. Cat # M0823) em uma diluição de 1:100; núcleos celulares foram contra com hematoxilina. (A) A baixa ampliação micrografia (10x) mostrando o implante (delimitada por uma linha tracejada preta) no contexto da envolvente tecidos do hospedeiro. Humano específico, CD31 positivo microvasos estão manchados de marrom (coloração com peroxidase). (B) de alta ampliação micrografia (40x) exibindo múltiplas humana microvasos (preto seta apontando para alguns lumens hCD31-positivo) dentro do plug.