Биоинженерия правам микрососудистой сети в иммунодефицитных мышей

1. Подготовка Сделать EGM-2 средних (500 мл) Добавить 100 мл эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) до 395 мл эндотелиальной базальной среды (ДМ-2). Добавьте 5 мл 100x Глютамин-пенициллин стрептомицин решение (GPS). Добавить все EGM-2 SingleQuots добавки, за исключением гидрокортизона (то есть, VEGF, hFGF-B, R-ИФР-1, hEGF, гепарин, аскорбиновая кислота, и GA-1000). Фильтр стерилизуют 0,2-мкм поры фильтра вакуумной размера. Сделать MSCGM средой (500 мл) Добавьте 5 мл 100x GPS до 440 мл мезенхимальных стволовых клеток базальной среды (MSCBM). Добавьте все содержимое комплекта MSCGM SingleQuots. Добавить hFGF-B аликвоту из EGM-2 SingleQuots добавок. Фильтр стерилизуют 0,2-мкм поры фильтра вакуумной размера. Сделать DMEM среде (500 мл) Добавьте 50 мл эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) до 440 мл 1x высокий уровень глюкозы в Дульбеко изменения Eagle Средняя (DMEM). Добавьте 5 мл GPS-100x. Добавьте 5 мл несущественные аминокислоты кислотный раствор. Фильтр стерилизуют 0,2-мкм поры фильтра вакуумной размера. Сделать коллаген / фибронектина решение (3,6 мл, сделал тот же день инъекции) Добавить 0,4 мл 10х DMEM до 150 мкл дистиллированной H 2 O. Добавить 100 мкл 1М HEPES (25 мМ финал). Осторожно, добавить 2,4 мл бычьего коллагена (5 мг / мл состава; 3 мг / мл заключительный) и аккуратно перемешать на льду. Отрегулируйте рН к нейтральному, добавляя 1N NaOH раствора (примерно 30 мкл). Используйте фенол красный индикатор для оценки нейтральный рН, альтернатива, используйте бумагу рН тест для контроля рН. Добавить 120 мкл человеческого фибронектина (1 мг / мл состава; 30 мкг / мл окончательный) Добавить 0,4 мл ФБС (10% окончательный) сохранять раствор на льду до использования. Сделать фибриногена раствор (1 мл, сделал тот же день инъекции) Добавить 30 мг порошкообразного фибриногена в 1 мл 0.9N NaCl (рН 7,4) раствор (30 мг / мл, финал). Перед использованием, инкубировать фибриногена раствора при температуре 37 ° С в течение 30 минут. Осторожно перемешать, без вортексе до его помимо коллагена / фибронектина геля. Сделать тромбина решение (200 мл) Добавьте 1 КУ порошковых тромбина до 200 мл 0,9% физиологического раствора NaCl (50 ед / мл). Фильтр стерилизуют 0,2-мкм поры фильтра размера шприца и храните при температуре от -20 ° C до использования. Перед использованием разбавить 0,9% физиологическим раствором NaCl до конечной концентрации 10 ед / мл. Сделать 1% раствора желатина (500 мл) Добавить 5 г порошкового желатина 500 мл фосфатного Дульбеко солевым буфером (PBS). В автоклаве при 121 ° С в течение 30 мин. Фильтр стерилизуют 0,2-мкм поры фильтра вакуумной размера. Пальто 100-мм пластин культуре ткани с добавлением 1% раствора желатина покрытием Добавьте 10 мл 1% раствора желатина, чтобы каждый 100-мм пластины культуры ткани. Инкубируйте пластин при 37 ° С в течение 60 мин. Перед использованием удалите раствор желатина и промыть пластины сразу с PBS. 2. Культуры прав пуповинной крови-Производные Эндотелиальная колониеобразующих клеток (ECFCs) Этот протокол предполагает, замороженных флаконов ECFC доступны в лаборатории до этого эксперимента. ECFC может быть изолирован от одноядерных фракции клеток либо пуповинной крови или взрослого периферической крови, как описано выше 7. Оттепель один флакон ECFCs (как правило, 0,5-1×10 6 клеток в 1 мл замораживания средств массовой информации), взятые из бака хранения азота и сразу же разбавлять его содержание в 15-мл коническую трубку, содержащую 10 мл среды DMEM. Спиновые при 1200 оборотов в минуту в течение 5 мин. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 10 мл теплой EGM-2 среды. Добавить 10 мл ECFC подвески в один 1% желатина покрытием 100-мм пластины тканевой культуры. Место пластины в увлажненном инкубаторе при температуре 37 ° С и 5% СО 2. На следующий день, мягко аспирата из несвязанных клеток и среды, и кормить связаны клеток с 10 мл свежего EGM-2 среды. Поток пластины каждые 2-3 дня с EGM-2 среды. Разрешить клетки расширить так, что пластина покрыта сотовой сливающийся монослой. При слиянии, субкультура клетки следующим образом: Аспирацию из культуральной среды и промыть клетки с 10 мл PBS. Удалить PBS и добавьте 2 мл трипсина-EDTA раствора в каждую 100-мм пластины. Осторожно пластин, чтобы равномерно распределить трипсина-EDTA решение. Инкубировать при 37 ° С и 5% CO 2 в течение 3-5 минут. Аккуратно нажмите на пластину, чтобы увидеть отдельные клетки в суспензии под инвертированным микроскопом. Когда клетки полностью отделить, добавить 8 мл EGM-2 средних и собирать ячейки решенияции в 15-мл коническую трубку. Возьмите 10 мкл для подсчета клеток в гемоцитометра и выработать общее число клеток, полученных. Пластина клеток в 1% желатина покрытием культуре ткани пластин при плотности посева в 5000 клеток / см 2, используя EGM-2 среды. Место пластин в инкубаторе и кормить их каждые 2-3 дня с EGM-2 среды. Повторите эту процедуру для последующих проходов. Следите за пассаж как клеточной популяции расширяется. ECFCs будет использоваться между проходы 4-8. 3. Культуры прав костномозгового происхождения мезенхимальные стволовые клетки (МСК) Этот протокол предполагает, замороженных флаконов человека MSC доступны в лаборатории до этого эксперимента. MSC может быть выделена из костного мозга всасывает, как описано выше 11. Оттепель один флакон МСК (как правило, 0,50-1×10 6 клеток в 1 мл замораживания средств массовой информации), взятые из бака хранения азота и сразу же разбавлять его содержание в 15-мл коническую трубку, содержащую 10 мл среды DMEM. Спиновые при 1200 оборотов в минуту в течение 5 мин. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 10 мл теплой среде MSCGM. Добавить 10 мл суспензии MSC в один без покрытия 100-мм пластины культуры ткани. Место пластины в увлажненном инкубаторе при температуре 37 ° С и 5% СО 2. На следующий день, мягко аспирата из несвязанных клеток и среды, и кормить связаны клеток с 10 мл свежей среды MSCGM. Поток пластины каждые 2-3 дня, со средним MSCGM. Разрешить клетки расширить так, что пластинка достигает 80% от сливной сотовой монослоя. У 80% слияния, субкультура клетки следующим образом: Аспирацию из культуральной среды и промыть клетки с 10 мл PBS. Удалить PBS и добавьте 2 мл трипсина-EDTA раствора в каждую 100-мм пластины. Осторожно пластин, чтобы равномерно распределить трипсина-EDTA решение. Инкубировать при 37 ° С и 5% СО2 в течение 3-5 минут. Аккуратно нажмите на пластину, чтобы увидеть отдельные клетки в суспензии под инвертированным микроскопом. Когда клетки полностью отделить, добавить 8 мл средней MSCGM и собирать ячейки раствор в 15-мл коническую трубку. Возьмите 10 мкл для подсчета клеток в гемоцитометра и выработать общее число клеток, полученных. Пластина клеток в ткани без покрытия пластин культуры в посевной плотностью 10000 клеток / см 2, используя MSCGM среды. Место пластин в инкубаторе и кормить их каждые 2-3 дня, со средним MSCGM. Повторите эту процедуру для последующих проходов. Следите за пассаж как клеточной популяции расширяется. МСК будет использоваться между проходы 4-8. 4. Ресуспендирования клеток в коллаген / Фибронектин / фибриногена Решение (день 0) До эксперимента, убедитесь, что Есть достаточно ECFCs и МСК в культуре; 0.8×10 6 ECFCs и 1.2×10 6 МСК будут необходимы для каждого имплантата и мышь. Аспирацию из среды каждая культура пластины и промыть клетки с 10 мл PBS. Удалить PBS и добавьте 2 мл трипсина-EDTA раствора в каждую 100-мм пластины. Осторожно пластин, чтобы равномерно распределить трипсина-EDTA решение. Инкубируйте в течение 3-5 минут. Аккуратно нажмите на пластину, чтобы увидеть отдельные клетки в суспензии под инвертированным микроскопом. Когда клетки полностью отделить, добавить 8 мл среды DMEM и собирать ячейки раствор в 15-мл коническую трубку. Возьмите 10 мкл для подсчета клеток в гемоцитометра и выработать общее количество ECFCs и МСК собраны. Передача 4×10 6 ECFCs (5x 0.8×10 6 клеток) и 6×10 6 ПДК (5x 1.2×10 6 клеток) в единую 50-мл коническую трубку. Это общее количество клеток, необходимых для пяти индивидуальных имплантатов и мышей. Центрифуга при 1200 оборотах в минуту и ​​удалите супернатант. Осторожно, добавьте 100 мкл Фибриноген решение до 0,9 мл коллагена / фибронектина решения (3 мг / мл конечная концентрация фибриногена); держать смесь на льду. Ресуспендируют осадок клеток в 1 мл ледяной коллаген / фибронектина / фибриногена решения; смешивать клетки очень осторожно, чтобы избежать пузырей. Нагрузка смесь в 1-мл стерильного шприца, и место 26-иглы с ее вершины на кончике шприца. Держите шприц загружается на льду до инъекции. 5. Инъекция в иммунодефицитом, обнаженная Мышь (день 0) Все эксперименты на животных, будет осуществляться с 6-недельных athymic ню (ню / ню) мышей. До инъекции, анестезия иммунодефицитных мышей, сгруппировав их в газовую камеру доставки изофлуран. Разрешить мышей вдохнуть изофлуран в течение примерно 2 минуты, пока они не под наркозом и не отвечает на носок щепотку (контроль за их бьется сердце, инспекции). Для каждой мыши, вводят 50 мкл раствора тромбина (10 Ед / мл) подкожно в верхней области спины использованием 26-иглы. <li> В том же месте, где был введен тромбина, вводят 200 мкл ячейки смеси с использованием 26-иглы. Коллаген будет гель при температуре 37 ° C и фибриногена фибрина образуют гель в присутствии тромбина. В результате, имплантат должен создать небольшую, но заметную, удар под кожей. После инъекции место мыши на слой марли для комфорта и тепла и наблюдать за ними, пока они не стали амбулаторно. Затем, после, наблюдать мышей в день в течение первых трех дней. 6. Сбор (День 7) Через неделю после инъекции, усыпить мышей, сгруппировав их в газовую камеру доставки сжатого CO 2 в газе. После эвтаназии, разрезать кожу вблизи области инъекции и хирургическим путем удалить гель пробки. Цифровые фотографии получены гель пробки с масштаба рекомендуется. Место собрано пробки геля в гистологических кассет и глубокого их в 10% нейтральном буферном растворе формалина в течение ночи при комнатной температуре. После фиксации, вымыть 10% нейтральный буферный формалин покончить с дистиллированной H 2 O и место гистологических кассет при 4 ° С в PBS до гистологического исследования. 7. Оценка: Гистология (H & E) и иммуногистохимии (hCD31) Для гистологического исследования, имплантаты в парафин и секционные (7 мкм толщиной секций) с использованием стандартных гистологических процедур. Количественная плотность микрососудов по оценке гематоксилином и эозином (H & E) окрашенных срезов, взятых из средней части имплантатов. Стандартные протоколы для H & E окрашивание может быть найден в другом месте. Микрососудов могут быть идентифицированы как lumenal структур, содержащих красные кровяные клетки. Доклад микрососудов плотности, как среднее количество красных кровяных клеток заполненных микрососудов с полей анализируются и в виде судов / мм 2. Чтобы продемонстрировать человеческую природу микрососудистых сосудов, участки получены имплантат должен быть иммуногистохимическое окрашивали человека конкретных CD31 (hCD31) антител с помощью стандартных протоколов окрашивания. Мы рекомендуем использовать мышь моноклональное анти-CD31 антител человека из DakoCytomation (Clone JC70A;. Кошка # M0823) в 1:100 разбавления. Человека специфику этого антитела было подтверждено негативную реакцию, полученные с разнообразием мыши срезах тканей, что были окрашены в параллельном 7,11. Следует отметить, что судами мыши крови часто видели внутри имплантатов (особенно в мире границу), но мышь суда, не запятнал положительным с этим антителом. Кроме того, присутствие человека MSC можно обнаружить с помощью иммуногистохимического окрашивания с деятельностью человека специфических антител против CD90 или α-актин гладких мышц (α-SMA). MSC человек находятся как в периваскулярные области новообразованных кровеносных сосудов и interstitially расположенных по всей имплантата 11. 8. Представитель Результаты Рисунок 1. Типичный вид ECFC и MSC культур. Микрофотографии фазового контраста отображения типичных появление ECFCs и МСК в культуре. (А) Сливной монослой пуповинной крови полученных ECFCs отображения характерных булыжником морфологии клеток эндотелия. (Б) Человеческие костномозгового происхождения МСК отображения морфологии шпинделя формы. Scaler баров, 200 мкм. Рисунок 2. Появление эксплантированных пробки на 7 день. Кровь человека полученных шнур ECFCs и костного мозга, полученных МСК были встроены в коллаген / фибронектина / фибрина гель и имплантированный под кожу безволосых мышей, как это описано в тексте. (А) Через 7 дней после того, как мыши были подвергнуты эвтаназии, разрезать кожу вблизи области инъекции и подвергать ячейки / гель плагин, щелкая кожи. (В) Внешний вид плагина удалены хирургическим путем от мыши и до формалина фиксации. Красный цвет имплантат указанием васкуляризации. Рисунок 3. Гистологическая идентификация сосудистой сети в эксплантированных зажигания. Гематоксилином и эозином (H & E) окрашенных срезов, взятых из средней части эксплантированных зажигания. () Низкая увеличением (10x) микрофотография отображения имплантата (отмечены желтым пунктиром) в контексте окружающих тканей хозяина (то есть, жировой ткани и скелетных мышц). (В) Высокое увеличение (40x) микрофотография отображение нескольких микрососудов (желтые стрелки указывают на некоторые из них) внутри плагина; микрососудов могут быть идентифицированы как lumenal структур, содержащих красные кровяные клетки. Рисунок 4. Иммуногистохимическое идентификации человеческихлюмен. иммуногистохимическое окрашенных срезов, взятых из средней части эксплантированных зажигания. Окрашивание проводили с использованием моноклональных мыши анти-CD31 человека (hCD31) антитела из DakoCytomation (Clone JC70A;. Кошка # M0823) в разведении 1:100; клеточных ядер были контрастно гематоксилином. () Низкая увеличением (10x) микрофотография отображения имплантата (выделенном черный пунктир) в контексте окружающих тканях хозяина. Человек конкретный, CD31-положительных микрососудов окрашиваются в коричневый (пероксидаза окрашивание). (В) Высокое увеличение (40x) микрофотография отображение нескольких человек микрососудов (черная стрелка указывает на некоторые hCD31-положительных люмен) внутри вилки.