Bioengineering Human Microvasculaire Netwerken in immunodeficiënte muizen

1. Voorbereiding Maak EGM-2 medium (500 ml) Voeg 100 ml foetaal bovine serum (FBS) tot 395 ml Endotheliale Basale Medium (EBM-2). Voeg 5 ml van de 100x-Glutamine penicilline-streptomycine-oplossing (GPS). Voeg alle EGM-2 SingleQuots supplementen, behalve voor hydrocortison (dat wil zeggen, VEGF, hFGF-B, R-IGF-1, hEGF, Heparine, ascorbinezuur, en GA-1000). Filter gesteriliseerd met een 0,2-um poriegrootte vacuüm filter. Maak MSCGM medium (500 ml) Voeg 5 ml 100x GPS tot 440 ml van mesenchymale stamcellen Basale Medium (MSCBM). Voeg de volledige inhoud van de MSCGM SingleQuots kit. Voeg hFGF-B aliquot van EGM-2 SingleQuots supplementen. Filter gesteriliseerd met een 0,2-um poriegrootte vacuüm filter. Maak DMEM medium (500 ml) Voeg 50 ml foetaal bovine serum (FBS) tot 440 ml 1x hoge glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM). Voeg 5 ml 100x GPS. Voeg 5 ml van de niet-essentiële aminozuren oplossing. Filter gesteriliseerd met een 0,2-um poriegrootte vacuüm filter. Maak collageen / fibronectine-oplossing (3,6 ml; gemaakt op dezelfde dag van de injectie) Voeg 0,4 ml van 10x DMEM tot 150 pi gedestilleerd H 2 O. Voeg 100 ul van 1 M HEPES (25 mM def.) Voorzichtig, voeg 2,4 ml van runderen collageen (5 mg / ml bouillon, 3 mg / ml definitief) en meng voorzichtig op het ijs. Stel de pH naar neutraal door toevoeging van 1 N NaOH-oplossing (ongeveer 30 pi). Gebruik fenolrood indicator voor neutrale pH-waarde te kunnen beoordelen; alternatief, gebruik pH-test papier om de pH te controleren. Voeg 120 ul van de menselijke fibronectine (1 mg / ml bouillon; 30 ug / ml definitief) Voeg 0,4 ml van de FBS (10% definitief) houden oplossing op ijs tot gebruik. Maak fibrinogeen-oplossing (1 ml; gemaakt op dezelfde dag van de injectie) Voeg 30 mg in poedervorm fibrinogeen tot 1 ml 0.9N NaCl (pH 7,4)-oplossing (30 mg / ml def.) Voorafgaand aan het gebruik, incubeer de fibrinogeenoplossing bij 37 ° C gedurende 30 minuten. Meng voorzichtig, zonder vortexen, voorafgaand aan de toevoeging ervan aan het collageen / fibronectine gel. Maak trombine-oplossing (200 ml) Voeg een KU van poedersuiker trombine tot 200 ml 0,9% NaCl normale fysiologische zoutoplossing (50 U / ml). Filter gesteriliseerd met een 0,2-um poriegrootte spuitfilter en bewaar bij -20 ° C tot gebruik. Voor gebruik verdunnen met 0,9% NaCl fysiologische zoutoplossing tot een uiteindelijke concentratie van 10 U / mL. Maak 1% gelatine-oplossing (500 ml) Voeg 5 g gelatine in poedervorm tot 500 ml van fosfaat Dulbecco's gebufferde zoutoplossing (PBS). Autoclaaf bij 121 ° C gedurende 30 minuten. Filter gesteriliseerd met een 0,2-um poriegrootte vacuüm filter. Coat 100-mm kultuurplaten met 1% gelatine coating-oplossing Voeg 10 ml van 1% gelatine oplossing voor iedere 100-mm weefselkweek plaat. Incubeer de platen bij 37 ° C gedurende 60 minuten. Voorafgaand aan het gebruik, verwijder dan de gelatine-oplossing en een keer wassen van de platen met PBS. 2. Cultuur van de mens navelstrengbloed afgeleide Endotheliale Colony Forming-Cells (ECFCs) Dit protocol veronderstelt bevroren flacons van ECFC zijn beschikbaar in het laboratorium voor dit experiment. ECFC kunnen worden geïsoleerd van de mononucleaire cel fractie van een van beide navelstrengbloed of volwassene perifeer bloed, zoals eerder beschreven 7. Dooi een flacon van ECFCs (meestal 0,5-1×10 6 cellen in 1 ml van de bevriezing media) uit de vloeibare stikstof opslagtank en onmiddellijk de inhoud ervan te verdunnen in een 15-mL conische buis met 10 ml DMEM medium. Draaien op 1200 rpm gedurende 5 minuten. Verwijder supernatant en resuspendeer de cel pellet in 10 ml warm EGM-2 medium. Voeg de 10 mL ECFC suspensie in een 1% gelatine gecoate 100-mm weefselkweek plaat. Plaats de plaat in een vochtige incubator bij 37 ° C en 5% CO 2. De volgende dag, Zuig voorzichtig uit niet-gebonden cellen en het medium, en diervoeders gebonden cellen met 10 ml vers EGM-2 medium. Voer de plaat om de 2-3 dagen met EGM-2 medium. Laat cellen uit te breiden zodanig dat de plaat wordt gedekt door een confluente cellulaire monolaag. Bij samenloop, subcultuur de cellen als volgt: Aspireren uit het kweekmedium en was de cellen met 10 ml PBS. Verwijder de PBS en voeg 2 ml trypsine-EDTA oplossing voor iedere 100-mm plaat. Schud de platen om gelijkmatig te verdelen de trypsine-EDTA-oplossing. Incubeer bij 37 ° C en 5% CO 2 voor 3-5 minuten. Tik voorzichtig de plaat naar de vrijstaande cellen in suspensie zie onder een omgekeerde microscoop. Wanneer de cellen helemaal los, voeg 8 ml van de EGM-2 medium en het verzamelen van de cel oplossingTIE in een 15-mL conische buis. Neem 10 pi om de cellen te tellen in een hemocytometer en uit te werken het totaal aantal geoogste cellen. Het bord van de cellen in 1% gelatine beklede weefsel cultuur platen bij een seeding dichtheid van 5000 cellen / cm 2 met behulp van EGM-2 medium. Leg de platen in de incubator en ze voeren om de 2-3 dagen met EGM-2 medium. Herhaal deze procedure voor de volgende passages. Blijf op de hoogte van de passage nummer als de cel bevolking is uitgebreid. ECFCs zal worden gebruikt tussen de passages 4-8. 3. Cultuur van de mens beenmerg-afgeleide mesenchymale stamcellen (MSC's) Dit protocol veronderstelt bevroren flesjes van het menselijke MSC zijn beschikbaar in het laboratorium voor dit experiment. MSC kunnen worden geïsoleerd uit het beenmerg zuigt zoals eerder 11 beschreven. Dooi een flacon van MSC's (meestal 0,50-1×10 6 cellen in 1 ml invriezen media) uit de vloeibare stikstof opslagtank en onmiddellijk de inhoud ervan te verdunnen in een 15-mL conische buis met 10 ml DMEM medium. Draaien op 1200 rpm gedurende 5 minuten. Verwijder supernatant en resuspendeer de cel pellet in 10 ml warm MSCGM medium. Voeg de 10 mL van de MSC-suspensie in een ongestreken 100-mm weefselkweek plaat. Plaats de plaat in een vochtige incubator bij 37 ° C en 5% CO 2. De volgende dag, Zuig voorzichtig uit niet-gebonden cellen en het medium, en diervoeders gebonden cellen met 10 ml vers MSCGM medium. Voer de plaat om de 2-3 dagen met MSCGM medium. Laat cellen uit te breiden zodanig dat de plaat 80% van de samenvloeiende cellulaire monolaag bereikt. Bij 80% confluentie, subcultuur de cellen als volgt: Aspireren uit het kweekmedium en was de cellen met 10 ml PBS. Verwijder de PBS en voeg 2 ml trypsine-EDTA oplossing voor iedere 100-mm plaat. Schud de platen om gelijkmatig te verdelen de trypsine-EDTA-oplossing. Incubeer bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 3-5 minuten. Tik voorzichtig de plaat naar de vrijstaande cellen in suspensie zie onder een omgekeerde microscoop. Wanneer de cellen helemaal los, voeg 8 ml MSCGM medium en het verzamelen van de cel-oplossing in een 15-mL conische buis. Neem 10 pi om de cellen te tellen in een hemocytometer en uit te werken het totaal aantal geoogste cellen. Het bord van de cellen in weefselkweek ongecoate platen bij een seeding dichtheid van 10.000 cellen / cm 2 met behulp van MSCGM medium. Leg de platen in de incubator en ze voeren om de 2-3 dagen met MSCGM medium. Herhaal deze procedure voor de volgende passages. Blijf op de hoogte van de passage nummer als de cel bevolking is uitgebreid. MSC's zal worden gebruikt tussen de passages 4-8. 4. Resuspensie van cellen in Collageen / fibronectine / fibrinogeenoplossing (Dag 0) Voorafgaand aan het experiment, zorg ervoor dat er voldoende ECFCs en MSC's in cultuur; 0.8×10 6 ECFCs en 1.2×10 6 MSC's nodig zullen zijn voor elk implantaat en muis. Aspireren uit het medium van elke cultuur bord en was de cellen met 10 ml PBS. Verwijder de PBS en voeg 2 ml trypsine-EDTA oplossing voor iedere 100-mm plaat. Schud de platen om gelijkmatig te verdelen de trypsine-EDTA-oplossing. Incubeer gedurende 3-5 minuten. Tik voorzichtig de plaat naar de vrijstaande cellen in suspensie zie onder een omgekeerde microscoop. Wanneer de cellen helemaal los, voeg 8 ml DMEM medium en het verzamelen van de cel-oplossing in een 15-mL conische buis. Neem 10 pi om de cellen te tellen in een hemocytometer en uit te werken het totale aantal ECFCs en MSC's geoogst. Overdracht 4×10 6 ECFCs (5x 0.8×10 6 cellen) en 6×10 6 mediterrane partnerlanden (5x 1.2×10 6 cellen) samen in een enkele 50-mL conische buis. Dit is de totale hoeveelheid cellen die nodig is voor vijf individuele implantaten en muizen. Centrifugeer bij 1200 rpm en verwijder het supernatant. Zacht, voeg 100 ul van fibrinogeen oplossing 0,9 ml van collageen / fibronectine-oplossing (3 mg / ml uiteindelijke fibrinogeen concentratie), dit mengsel op ijs. Resuspendeer de cel pellet op 1 ml ijskoude collageen / fibronectine / fibrinogeenoplossing, mengen de cellen zeer voorzichtig om luchtbellen te vermijden. Laad het mengsel in een 1-ml steriele spuit en plaats een 26-gauge naald met zijn pet op de punt van de spuit. Houd de geladen spuit op het ijs tot de injectie. 5. Injectie in immuundeficiënte Naakt Mouse (Day 0) Alle dierlijke experimenten zullen worden uitgevoerd met 6-week oud athymische naakt (nu / nu) muizen. Voorafgaand aan de injectie, verdoven de immunodeficiënte muizen door ze in een gaskamer het leveren van isofluraan. Laat de muizen om de isofluraan inhaleren voor ongeveer 2 minuten tot ze verdoofd en reageert tot teen knijpen (monitor hun hart klopt door de inspectie). Voor elke muis, injecteren 50 ul van trombine-oplossing (10 U / ml) subcutaan in de bovenste dorsale regio met behulp van een 26-gauge naald. <li> Op dezelfde plaats waar trombine werd geïnjecteerd, injecteren 200 pi van de cel mengsel met behulp van een 26-gauge naald. Collageen gel bij 37 ° C en fibrinogeen zal vormen fibrine-gel in de aanwezigheid van trombine. Als gevolg daarvan moet het implantaat vormen een kleine, maar merkbare, bobbel onder de huid. Na de injectie, plaatst u de muizen op een laag gaas voor comfort en warmte en observeren ze totdat ze ambulant. Dan na, dagelijks houden aan de muizen voor de eerste drie dagen. 6. Oogsten (Dag 7) Een week na de injecties, euthanaseren de muizen door ze in een gaskamer het leveren van samengeperst CO 2 gas. Eenmaal gedood, opengesneden de huid in de buurt van het gebied van de injectie en chirurgisch te verwijderen van de gel plug. Digitale foto's van de opgehaalde gel stekkers met een schaal worden geadviseerd. Plaats de geoogste gel stekkers in histologische cassette en diep ze in 10% neutraal gebufferde formaline gedurende de nacht bij kamertemperatuur. Na fixatie, was het 10% neutraal gebufferde formaline weg met gedestilleerd H 2 O en plaats de histologische cassettes bij 4 ° C in PBS tot histologische evaluatie. 7. Evaluatie: Histologie (H & E) en immunohistochemie (hCD31) Voor histologische evaluatie, zijn de implantaten ingebed in paraffine en coupes (7 micrometer dikke delen) met behulp van standaard-histologische procedures. Kwantificeren microvessel dichtheid door een evaluatie van Hematoxilin en eosine (H & E) gekleurde coupes genomen uit het middelste deel van de implantaten. Standaard protocollen voor H & E kleuring kan elders worden gevonden. Microvaten kunnen worden geïdentificeerd als lumenale structuren die rode bloedcellen bevatten. Rapport bloedvaten dichtheid als het gemiddeld aantal rode bloedcellen gevulde bloedvaten uit het veld geanalyseerd en uitgedrukt als schepen / mm 2. Om aan te tonen van de menselijke natuur van de microvasculaire schepen, delen van de opgehaalde implantaat moet immunohistochemisch worden gekleurd met een mens-specifieke CD31 (hCD31) antilichaam met behulp van standaard kleuringen protocollen. Wij raden het gebruik van de muis monoklonaal anti-humaan CD31 antilichaam van DakoCytomation (Clone JC70A;. Kat # M0823) bij een 1:100 verdunning. De menselijke specificiteit van dit antilichaam is bevestigd door de negatieve reactie die wordt verkregen met een diversiteit van de muis weefselcoupes die werden gekleurd in parallel 7,11. Van de nota, muis bloedvaten vaak gezien in de implantaten (speciaal rond de grens), maar de muis schepen zal niet positief vlek met dit antilichaam. Daarnaast kan de aanwezigheid van de menselijke MSC worden gedetecteerd door immunohistochemische kleuring met mens-specifieke antilichamen tegen CD90 of α-gladde spiercel actine (α-SMA). Menselijke MSC zijn te vinden zowel in de perivasculaire regio van nieuw gevormde bloedvaten en interstitially verspreid over het implantaat 11. 8. Representatieve resultaten Figuur 1. Typische uitzicht van ECFC en MSC culturen. Fase contrast microfoto weergave van het typische uiterlijk van ECFCs en MSC's in de cultuur. (A) Confluente monolaag van navelstrengbloed afgeleide ECFCs het weergeven van de karakteristieke keien stenen morfologie van endotheelcellen. (B) Human beenmerg-afgeleide MSC's tonen van een spindel vorm morfologie. Scaler bars, 200 um. Figuur 2. Verschijning van geëxplanteerde stekkers op dag 7. Menselijk navelstrengbloed afgeleide ECFCs en beenmerg-afgeleide MSC's zijn ingebed in collageen / fibronectine / fibrine gel en subcutaan geïmplanteerd in muizen naakt, zoals beschreven in de tekst. (A) Na 7 dagen, nadat de muis is gedood, opengesneden de huid in de buurt van het gebied van de injectie en bloot de cel / gel stekker omkeren door de huid. (B) Uiterlijk van de stekker chirurgisch verwijderd van de muis en voorafgaand aan de formaline fixatie. De rode kleur van het implantaat is een indicatie van vascularisatie. Figuur 3. Histologische identificatie van vasculaire netwerk in geëxplanteerd pluggen. Hematoxilin en eosine (H & E) gekleurde coupes genomen uit het middelste deel van de geëxplanteerd pluggen. (A) lage vergroting (10x) microfoto het weergeven van het implantaat (gemarkeerd door een gele onderbroken lijn) in het kader van de omliggende weefsels gastheer (dat wil zeggen, vetweefsel en skeletspieren). (B) High vergroting (40x) microscoop het weergeven van meerdere microvaten (gele pijlpunt wijst op een aantal van hen) in de stekker microvaten geïdentificeerd kan worden als lumenale structuren die rode bloedcellen bevatten. Figuur 4. Immunohistochemische identificatie van menselijkelumen. immunohistochemisch gekleurde coupes genomen uit het middelste deel van de geëxplanteerd pluggen. Kleuring werd uitgevoerd met behulp van een monoklonaal muis anti-humaan CD31 (hCD31) antilichaam van DakoCytomation (Clone JC70A;. Kat # M0823) bij een 1:100 verdunning; celkernen werden tegengekleurd met hematoxilin. (A) lage vergroting (10x) microfoto het weergeven van het implantaat (afgebakend door een zwarte stippellijn) in de context van de omliggende weefsels gastheer. Menselijke specifieke, CD31-positieve microvaten zijn gekleurd in bruin (peroxidase kleuring). (B) High vergroting (40x) microscoop het weergeven van meerdere menselijke microvaten (zwarte pijlpunt wijst op een positieve hCD31-lumen) in de stekker.