Floresan In-Situ Hibridizasyon ve Konfokal Lazer Tarama Mikroskopi Palatal Genişleticilerden Oral Biyofilm Analizi
Summary
Ortodontik aletler doğal oral biyofilm yapısal ve kompozisyon analizi için bir protokol mevcut<em> Yerinde</em> Hibridizasyon (FISH) ve konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM). Oral biyofilm örnekleri kapalı akrilik reçine gevreği, yüzey kazıma ve moleküler işleme için onları yönlendiren, damak genişleticiler toplanmıştır.
Abstract
Doğal heterojen biyofilm Konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) onları situ hibridizasyon (FISH) floresan olma boyama teknikleri, geniş bir ürün yelpazesiyle bugün kolaylaştırmıştır. 1,2 oral biyofilm örnekleri sabit toplanan hangi bir pilot çalışma gerçekleştirilmiştir FISH, üç boyutlu bir organizasyon doğal biyofilm ve plak birikimi değerlendirmek için objektif ortodontik aletler (damak genişleticiler) ile boyandı 3,4 BALIK floresan etiketli 16S kullanımı ile kendi ana biyofilm ortamında hücreleri leke için bir fırsat yaratır rRNA hedef sondalar. 4-7,19 immunofluorescent etiketleme gibi alternatif teknikler karşılaştırıldığında, bu karma biyofilm konsorsiyumların içinde farklı bakteriyel gruplar araştırmak için ucuz, hassas ve basit etiketleme tekniği. 18,20 Genel problar kullanıldı Öbakteriler bağlamak ( EUB338 + EUB338II + EUB338III bundan EUBmix), 8-10 Firmicutes (LGC354 AC; bundan LGCmix), 9,10 ve Bacteroidetes (Bac303) 11. Buna ek olarak, Streptococcus mutans bağlanarak spesifik problar (MUT590) 12,13 ve Porphyromonas gingivalis (POGI) 13,14 . Katılan yüzey malzemeleri aşırı sertlik (paslanmaz çelik ve akrilik reçine), biyofilm hazırlanması için yeni yollar bulmak için bizi zorladı. Kriyotom ile bu yüzey malzemeleri kolaylıkla kesilebilir olamazdı olarak, sağlam sözlü biyofilm elde etmek için çeşitli örnekleme yöntemleri araştırıldı. Bu yaklaşımların en uygulanabilir, bu iletişimi sunulmaktadır. Biyofilm taşıyan akrilik reçine Küçük gevreği biyofilm yapısına zarar vermemeye dikkat ederek, steril bir bisturi ile kazınmış. Forseps çelik yüzeylerde biyofilm toplamak için kullanıldı. Bir kez toplanan numunelerin sabit ve polysine kaplı cam slaytlar doğrudan yerleştirildi. FISH probları m doğrudan bu slaytları yapıldıYukarıda entioned. Çeşitli BALIK protokolleri kombine ve kullanımı kolay yeni bir protokol oluşturmak için modifiye edilmiştir. 5,10,14,15 Daha sonra numuneler konfokal lazer tarama mikroskobu ile incelendi. Tanınmış yapılandırmaları 3,4,16,17 mantar tarzı oluşumlar ve kanallar tarafından kaplanır coccoid bakteri kümeleri dahil olmak üzere, görüntülenmiştir olabilir. Buna ek olarak, bu tipik biyofilm yapıların bakteriyel bir kompozisyon analiz ve 2D ve 3D görüntüler oluşturdu.
Protocol
Discussion
Açıklanan protokol burada, sert malzemeler için toplanan boyama biyofilm yüksek uygulanabilir bir yaklaşımdır. Örnekleme ve hibridizasyon en kritik adımlar. Örnekleme sırasında, bakım, yeterli kalınlıkta dilimler biyofilm yapısı bozulmadan kalmasını sağlamak için toplanan alınmalıdır. Hibridizasyon sırasında, böylece kaçınarak, non-spesifik floresan etiketli probları bağlama, ya da bağlayıcı kaybı, aşırı sıcaklık dalgalanmaları önlemek için çok önemlidir. Bu BALIK protokol Bileşiminde bozmadan cam slaytlar doğrudan normal heterojen biyofilm leke zarif bir yöntemdir. Slaytlar hemen mikroskopi için bir kez daha örnek taşımak için bir gerek kalmadan kullanılabilir. Bu yolla, Tüplerde boyama üzerinde bir iyileşme biyofilm uygulanmakta olan daha az kesme kuvveti elde edilir. > 50 mikron kalınlığında Dilimleri Bu şekilde hazırlanan ve araştırılmalıdır.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Hijyen Viyana Tıp Üniversitesi Graz tarafından desteklenmiştir. Tüm denekler bilgilendirilmiş onam verdi. Kurumsal çalışma protokolü ile ilgili onayı Üniversitesi Tıp Fakültesi Graz elde edildi.
Materials
| Oligonucleotides | Target organism | Fluorochrome |
|---|---|---|
| EUB338 – 338III | Eubacteria | Cy3 |
| LGC354 A-C | Firmicutes | FITC |
| Bac303 | Bacteroidetes | Cy5 |
| Mut590 | Streptococcus mutans | FITC |
| POGI | Porphyromonas gingivalis | FITC |
Table 3. Oligonucleotides (refer to probeBase13 for details).
| Component | Company | Comments |
|---|---|---|
| 4% paraformaldehyde | 4% solution in PBS | |
| 1 x PBS | 3 x solution prepared | |
| ddH2O | Millipore | |
| Ethanol (100%) | Merck | |
| Lysozyme | Roth | 100 mg/ml stock solution |
| Formamide | Roth | 99.5% solution |
| 5 M NaCl | Roth | |
| 1 M Tris-HCl | Roth | |
| 2% SDS | Roth | |
| FISH probes (oligonucleotides) | Invitrogen, Sigma | |
| ProLong Gold antifadent | Invitrogen | |
| Nail polish | ||
| Equipment | ||
| Incubator | Thermo Scientific | |
| Water bath | IKA Tez | |
| 50 ml tubes | Sarstedt | |
| Polysine-coated slides | Thermo Scientific |
Table 4. Materials and equipment.
References
- Sunde, P. T. Fluorescence in situ hybridization (FISH) for direct visualization of bacteria in periapical lesions of asymptomatic root-filled teeth. Microbiology. 149, 1095-1102 (2003).
- Sussman, M., Loya, Y., Fine, M., Rosenberg, E. The marine fireworm Hermodice carunculata is a winter reservoir and spring-summer vector for the coral-bleaching pathogen Vibrio shiloi. Environ. Microbiol. 5, 250-255 (2003).
- Kolenbrander, P. E. Communication among oral bacteria. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 66, 486-505 (2002).
- Zijnge, V. Oral biofilm architecture on natural teeth. PLoS One. 5, e9321-e9321 (2010).
- Thurnheer, T., Gmur, R., Giertsen, E., Guggenheim, B. Automated fluorescent in situ hybridization for the specific detection and quantification of oral streptococci in dental plaque. J. Microbiol. Methods. 44, 39-47 (2001).
- Hojo, K., Nagaoka, S., Ohshima, T., Maeda, N. Bacterial interactions in dental biofilm development. J. Dent. Res. 88, 982-990 (2009).
- Jung, D. J. Visualization of initial bacterial colonization on dentine and enamel in situ. J. Microbiol. Methods. 81, 166-174 (2010).
- Al-Ahmad, A. Bacterial colonization of enamel in situ investigated using fluorescence in situ hybridization. J. Med. Microbiol. 58, 1359-1366 (2009).
- Bryers, J. D. Medical biofilms. Biotechnol. Bioeng. 100, 1-18 (2008).
- Cardinale, M., Vieira de Castro, J., Muller, H., Berg, G., Grube, M. In situ analysis of the bacterial community associated with the reindeer lichen Cladonia arbuscula reveals predominance of Alphaproteobacteria. FEMS Microbiol. Ecol. 66, 63-71 (2008).
- Aas, J. A., Paster, B. J., Stokes, L. N., Olsen, I., Dewhirst, F. E. Defining the normal bacterial flora of the oral cavity. J. Clin. Microbiol. 43, 5721-5732 (2005).
- Chin, M. Y., Busscher, H. J., Evans, R., Noar, J., Pratten, J. Early biofilm formation and the effects of antimicrobial agents on orthodontic bonding materials in a parallel plate flow chamber. Eur. J. Orthod. 28, 1-7 (2006).
- Loy, A., Maixner, F., Wagner, M., Horn, M. probeBase–an online resource for rRNA-targeted oligonucleotide probes: new features 2007. Nucleic. Acids. Res. 35, (2007).
- Diaz, P. I. Molecular characterization of subject-specific oral microflora during initial colonization of enamel. Appl. Environ. Microbiol. 72, 2837-2848 (2006).
- Dige, I., Nilsson, H., Kilian, M., Nyvad, B. In situ identification of streptococci and other bacteria in initial dental biofilm by confocal laser scanning microscopy and fluorescence in situ hybridization. Eur. J. Oral Sci. 115, 459-467 (2007).
- Kolenbrander, P. E. Bacterial interactions and successions during plaque development. Periodontology. 42, 47-79 (2000).
- Kolenbrander, P. E., Palmer, R. J., Periasamy, S., Jakubovics, N. S. Oral multispecies biofilm development and the key role of cell-cell distance. Nat. Rev. Microbiol. 8, 471-480 (2010).
- Chalmers, N. I. Use of quantum dot luminescent probes to achieve single-cell resolution of human oral bacteria in biofilms. Appl. Environ. Microbiol. 73, 630-636 (2007).
- Wecke, J. A novel technique for monitoring the development of bacterial biofilms in human periodontal pockets. FEMS Microbiol. Lett. 191, 95-101 (2000).
- Moter, A., Gobel, U. B. Fluorescence in situ hybridization (FISH) for direct visualization of microorganisms. J. Microbiol. Methods. 41, 85-112 (2000).
