Análisis de biofilm oral del paladar Expansores por fluorescencia de hibridación in situ y microscopía de escaneo láser confocal

1. Recogida de muestras Quitar fija expansores palatinos después de 4 meses de servicio intraoral. Utilizar el Sistema de NOLA campo seco para aislar a los aparatos antes de sacarlos (Figuras 1 y 2). Utilice pinzas esterilizadas, guantes y bandejas para eliminar la contaminación sin necesidad de añadir expansores (Figuras 3 y 4). Almacenar objetos en Sarstedt 120 ml viales a -20 ° C. Tome al laboratorio en hielo y el proceso dentro de las 24 horas. 2. Biofilm fijación Raspar escamas biofilm con un bisturí estéril, o cobrar piezas con una pinza estéril. Añadir helada solución al 4% PFA hasta que la muestra está bien cubierta. Incubar la mezcla a 4 ° C (no congelar) de 3 a 12 horas. Ya veces la fijación o la fijación de las temperaturas más altas pueden hacer que la envoltura celular de bacterias gram-negativos células menos permeable a las sondas de oligonucleótidos. Retire la solución PFA y lavar con helado de PBS 1X. Repita este paso 2-3 veces a la remove residual PFA. Resuspender la muestra en un vol. helado de PBS 1X y añadir vol 1. helada del 96% (v / v) de etanol. Almacenar las muestras a -20 ° C. Las muestras fijadas de acuerdo con este protocolo se pueden almacenar por varios meses o años. 3. La deshidratación de las muestras fijas Aplicar l 50-30 de PFA-fijo material de la muestra a un portaobjetos de microscopio. Seco a 46 ° C durante 15 min a temperatura ambiente o durante más tiempo. Descongele la lisozima y la formamida. Añadir 250 l de lisozima (1mg/ml) a temperatura ambiente durante 10 minutos, lo que facilita la penetración de las sondas en las células por la destrucción parcial de las paredes celulares. Dip caer en 50%, 80% y 96% (v / v) de etanol durante 3 minutos cada uno. El efecto deshidratante de la serie de la concentración de etanol va a desintegrar las membranas celulares. Secar los portaobjetos a 46 ° C durante 10 min. 4. Hibridación in situ Prepare 1 ml detampón de hibridación fresca (ver Tabla 1 para la concentración). Las concentraciones de formamida utilizados en este estudio: 10% (EUBmix), el 20% (Bac303, institución de giro postal, MUT590) o 45% (LGCmix). Descongele las soluciones sonda de oligonucleótidos. Sondas descongelado debe mantenerse en hielo y protegido de la luz. Añadir 2 l de cada sonda de 200 l de tampón de hibridación, mezclar bien y aplicar la mezcla de la muestra deshidratada en un portaobjetos de microscopio. Coloque un pedazo de papel de seda en una plaza una placa de Petri y verter el resto de tampón de hibridación en el papel de seda. Inmediatamente colocar la placa horizontal en el plato y cerca del plato. Incubar en una estufa a 46 ° C durante 1-5 horas (90 minutos será suficiente en la mayoría de los casos). Las funciones de plato como una cámara de humedad evitando la evaporación de la solución de hibridación de la diapositiva. En particular, la evaporación de la formamida puede causar no específicos de la sonda unión a las células no deseadas. Prepare 50 ml de tampón de lavado (ver Tabla 2 para concentrations). Prepare la solución de lavado en un tubo de 50 ml y de precalentamiento a 48 ° C en un baño de agua. La etapa de lavado se realiza a 48 ° C. Retirar la cápsula con la tapa del horno de hibridación. Lávese inmediatamente el tampón de hibridación con un pequeño volumen de tampón de lavado pre-calentado, y la transferencia de la diapositiva en el buffer de lavado restante. Coloque el tubo que contiene el tampón de lavado y deslice la espalda en el baño de agua y se incuba a 48 ° C durante 10-15 min. Eliminar diapositiva del tubo y echar mano helada ddH 2 O durante 2-3 segundos para eliminar el tampón de lavado residual. Deje secar al aire la diapositiva lo más rápido posible (el uso de aire comprimido se recomienda). De secado rápido se reducirá la sonda disociación. Diapositivas seco se puede almacenar en la oscuridad a -20 ° C durante varias semanas sin una pérdida significativa de la sonda, confiere señal de fluorescencia. 5. Microscopía Después de FISH y lavado, aply dos gotas de cerca antifadent a los extremos izquierdo y derecho de una diapositiva (rodajas congeladas se debe calentar a temperatura ambiente antes de este paso). Coloque una cubierta microscopio de deslizamiento en la parte superior y esperar hasta que el antifadent se ha extendido por toda la diapositiva. Tenga en cuenta que una cantidad excesiva de antifadent puede distorsionar la imagen del microscopio. Observar las muestras con un microscopio láser confocal de barrido equipados con filtros adecuados o láser. Se utilizó un Leica TCS unidad (HCX PL APO/63x; NA 1.2). Los datos pueden ser analizados con el software como Imaris o AMIRA. Diapositivas integrados en antifadent se puede almacenar a 4 ° C (no congelar) hasta 7 días antes de la sonda, confiere fluorescencia comienza a declinar. Por otra parte, la antifadent se puede quitar con ddH2O, y las diapositivas seco se puede almacenar a -20 ° C durante un período prolongado de tiempo. 6. Los resultados representativos: Raspado del biofilm de aparatos ortodóncicos fijos (Figura 5) los rendimientos de copos adecuado (Figura 6) que puede ser hibridado directamente sobre láminas de vidrio recubierto para microscopía. De esta manera, los diferentes grupos de bacterias orobiome se pueden identificar en sus recursos naturales, entorno tridimensional por rRNA bacteriano etiquetado con diferente marcado con sondas específicas (Figuras 7 y 8). En la figura 7, la biopelícula se tiñeron con EUBmix (verde, todas las bacterias) y LGCmix (amarillo, Firmicutes). Firmicutes aparecen en color verde, ya que estaban manchadas de amarillo y azul. En la Figura 8, la biopelícula se tiñeron con EUBmix (rojo, todas las bacterias), Bac303 (azul, Bacteroidetes) y instituciones de giro postal (amarillo, Porphyromonas gingivalis). Gingivalis se muestra en color blanco amarillento, como las tres sondas se unen a su ADN y la superposición de de los resultados de los colores en una señal de blanco. Las diferencias morfológicas entre los grupos de bacterias también pueden ser identificados (Figuras 9 y 10). Grandes grupos de bacterias cocoides se muestra en la Figura 9, donde la tinción se realizó con EUBmix (verde, todos los bacteria). Diferentes formas de las bacterias orales se visualizaron en la Figura 10, donde las bacterias cocoides y filamentosas se pueden distinguir por la tinción con EUBmix (rojo). Además, una típica seta-como la estructura del biofilm pueden ser procesados ​​a través del modelado 3D de los datos CLSM (Figuras 11 y 12) Haga clic aquí para ver una película de la modelación 3D. Figura 1. Expansor palatino fijo in situ. Figura 2. Sistema de Nola campo seco. Figura 3. Pinzas esterilizadas, guantes y una bandeja. Figura 4. Eliminado de expansión. Figura 5. Raspado de biofilm con un bisturí estéril. Escamas de la figura 6. Resina directamente hibridizada en portaobjetos de vidrio recubierto. Figura 7 CLSM imagen:. Diferenciación de un grupo de bacterias específicas. Superposición de los datos 2D en 3D CLSM pila. Biofilm teñidas con EUBmix (verde, todas las bacterias) y LGCmix (amarillo, Firmicutes). Figura 8 CLSM imagen:. Diferenciación de un grupo de bacterias específicas. Superposición de los datos 2D en 3D CLSM pila. Biofilm teñidas con EUBmix (rojo, todas las bacterias), Bac303 (azul, Bacteroidetes) y instituciones de giro postal (amarillo, Porphyromonas gingivalis). Figura 9 CLSM imagen:. Diferenciación de las morfologías específicas. Superposición de los datos 2D en 3D CLSM pila. Biofilm teñidas con EUBmix (verde, todas las bacterias). Grandes grupos de bacterias cocoides (flechas). . Figura 10 imágenes CLSM: la diferenciación de las morfologías específicas. Superposición de los datos 2D en 3D CLSM pila. Biofilm teñidas con EUBmix (rojo, todas las bacterias). Cocoides (flecha abajo) y bacterias filamentosas (flecha arriba) se pueden distinguir. Figura 11. Estructura de hongos, vistas en 3D desde abajo. Las pilas de copos biofilm (raspado de la superficie de un aparato de ortodoncia), teñidas con EUBmix y procedimientosssed con Imaris (imagen CLSM). Figura 12. Estructura de hongos, vista lateral en 3D. Las pilas de copos biofilm (raspado de la superficie de un aparato de ortodoncia) elaborado con Imaris (imagen CLSM). La hibridación de amortiguación (200 l) Concentración de formamida 10% 20% 45% 5 M NaCl 36 36 36 1 M Tris-HCl 4 4 4 2% de SDS 1 1 1 FA 20 40 90 <strong> DdH2O 138 118 68 Cualquier FISH sonda 2 2 2 Tabla 1. Componentes de tampón de hibridación (concentraciones en l). Tampón de lavado (50 ml) Concentración de formamida 10% 20% 45% 5 M NaCl 4500 2150 300 1 M Tris-HCl 1000 1000 1000 EDTA 0,5 M 0 500 500 ddH2O 44 500 46 350 </td> 48 200 Tabla 2. Constituyentes de tampón de lavado (concentraciones en l). Movie 1. Haga clic aquí para ver la película.