Biofilm ניתוח שבעל פה של Palatal expanders על ידי הכלאה ב-situ פלואורסצנטי מיקרוסקופיה Confocal סריקת לייזר
Summary
אנו מציגים פרוטוקול לניתוח מבניים ההלחנה של biofilm אוראלי טבעי עם מכשירים אורתודונטים<em> באתרו</emהכלאה> (FISH) ו מיקרוסקופיה confocal סריקת לייזר (CLSM). דגימות biofilm אוראלי נאספו palatal expanders, גירוד, שרף אקרילי פתיתי את פני השטח שלהם ומתייחסים אליהם לעיבוד מולקולרית.
Abstract
לייזר Confocal מיקרוסקופיית (CLSM) של biofilm הטרוגנית טבעית היום בהנחייתם של מגוון רחב של טכניקות צביעה, אחד מהם הוא הקרינה הכלאה באתרו (FISH). 1,2 ביצענו מחקר פיילוט שבו דגימות biofilm אוראלי שנאספו קבוע מכשירי אורתודונטי (palatal expanders) הוכתמו על ידי דגים, המטרה להיות כדי להעריך את הארגון התלת מימדי של biofilm טבעי הצטברות פלאק. 3,4 דגים יוצר הזדמנות להכתים תאים בסביבה biofilm האם שלהם על ידי שימוש 16S שכותרתו fluorescently rRNA במיקוד בדיקות. 4-7,19 לעומת טכניקות חלופיות כמו תיוג immunofluorescent, זוהי טכניקה זולה, וסימון מדויק וישיר לחקור קבוצות חיידקים שונים קונסורציומים biofilm מעורבת. 18,20 בדיקות כלליות שימשו אשר נקלטות על ידי Eubacteria ( EUB338 + + EUB338II EUB338III; להלן EUBmix), 8-10 Firmicutes (LGC354 AC;. LGCmix להלן), 9,10 ו Bacteroidetes (Bac303) 11 בנוסף, בדיקות ספציפיות מחייב mutans סטרפטוקוקוס (MUT590) 12,13 ו gingivalis Porphyromonas (POGI) 13,14 שימשו . הקשיות קיצונית של החומרים משטח מעורב (נירוסטה שרף אקרילי) אילצה אותנו למצוא דרכים חדשות להכנת biofilm. כאשר חומרים אלה משטח לא ניתן לחתוך בקלות עם cryotome, שיטות דגימה שונים נחקרו להשיג biofilm אוראלי ללא פגע. עביד ביותר של גישות אלה מוצגת בתקשורת זו. פתיתים קטנים של שרף biofilm נושאי אקריליק היו לגרד עם אזמל סטרילי, נזהרת שלא לפגוע במבנה biofilm. מלקחיים ששימשו לאיסוף biofilm מן משטחי פלדה. לאחר שנאספו, מהדגימות היו קבועים ממוקם ישירות על polysine שקופיות זכוכית מצופה. FISH בוצעה ישירות עם מ 'בדיקות בשקופיות אלהentioned לעיל. פרוטוקולים דגים שונים היו משולבים שונה כדי ליצור פרוטוקול חדש זה היה קל להתמודד. 5,10,14,15 לאחר מכן הדגימות נותחו על ידי מיקרוסקופ לייזר confocal סריקה. ידוע תצורות 3,4,16,17 יכול להיות דמיינו, כולל פטריות בסגנון תצורות ואשכולות של חיידקים coccoid הספוגה ערוצים. בנוסף, הרכב חיידקי של מבנים אלה biofilm טיפוסי נותחו ותמונות 2D and 3D נוצר.
Protocol
Discussion
להלן פרוטוקול המתואר היא גישה מעשית מאוד biofilms מכתים שנאספו חומרים קשים. דגימה הכלאה השלבים הקריטיים ביותר. במהלך הדגימה, יש להקפיד כי פרוסות בעובי הולם נאספים כדי להבטיח את מבנה biofilm נשאר שלם. במהלך ההכלאה, זה חיוני כדי למנוע תנודות מוגזמות בטמפרטורה, ובכך נמנע הלא ספציפית מחייב, או אובדן של הכריכה, של בדיקות שכותרתו fluorescently. זה פרוטוקול FISH היא שיטה אלגנטית להכתים biofilm הטרוגנית רגילה ישירות על שקופיות זכוכית מבלי לשבש את הרכבו. השקופיות יכול מיד לשמש מיקרוסקופיה ללא צורך להזיז את המדגם שוב. בדרך זו, שיפור פני מכתים בתוך צינורות מושגת על ידי כוח גזירה פחות מוחל על biofilm. Slices> 50 מיקרומטר עבה יכול להיות מוכן לחקור באופן זה.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי Fonds היגיינה של הרפואי של אוניברסיטת גראץ. כל הנבדקים נתנו את הסכמתם המיודעת. לאישור מוסדי של פרוטוקול המחקר שהתקבלו לרפואה של אוניברסיטת גראץ.
Materials
| Oligonucleotides | Target organism | Fluorochrome |
|---|---|---|
| EUB338 – 338III | Eubacteria | Cy3 |
| LGC354 A-C | Firmicutes | FITC |
| Bac303 | Bacteroidetes | Cy5 |
| Mut590 | Streptococcus mutans | FITC |
| POGI | Porphyromonas gingivalis | FITC |
Table 3. Oligonucleotides (refer to probeBase13 for details).
| Component | Company | Comments |
|---|---|---|
| 4% paraformaldehyde | 4% solution in PBS | |
| 1 x PBS | 3 x solution prepared | |
| ddH2O | Millipore | |
| Ethanol (100%) | Merck | |
| Lysozyme | Roth | 100 mg/ml stock solution |
| Formamide | Roth | 99.5% solution |
| 5 M NaCl | Roth | |
| 1 M Tris-HCl | Roth | |
| 2% SDS | Roth | |
| FISH probes (oligonucleotides) | Invitrogen, Sigma | |
| ProLong Gold antifadent | Invitrogen | |
| Nail polish | ||
| Equipment | ||
| Incubator | Thermo Scientific | |
| Water bath | IKA Tez | |
| 50 ml tubes | Sarstedt | |
| Polysine-coated slides | Thermo Scientific |
Table 4. Materials and equipment.
References
- Sunde, P. T. Fluorescence in situ hybridization (FISH) for direct visualization of bacteria in periapical lesions of asymptomatic root-filled teeth. Microbiology. 149, 1095-1102 (2003).
- Sussman, M., Loya, Y., Fine, M., Rosenberg, E. The marine fireworm Hermodice carunculata is a winter reservoir and spring-summer vector for the coral-bleaching pathogen Vibrio shiloi. Environ. Microbiol. 5, 250-255 (2003).
- Kolenbrander, P. E. Communication among oral bacteria. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 66, 486-505 (2002).
- Zijnge, V. Oral biofilm architecture on natural teeth. PLoS One. 5, e9321-e9321 (2010).
- Thurnheer, T., Gmur, R., Giertsen, E., Guggenheim, B. Automated fluorescent in situ hybridization for the specific detection and quantification of oral streptococci in dental plaque. J. Microbiol. Methods. 44, 39-47 (2001).
- Hojo, K., Nagaoka, S., Ohshima, T., Maeda, N. Bacterial interactions in dental biofilm development. J. Dent. Res. 88, 982-990 (2009).
- Jung, D. J. Visualization of initial bacterial colonization on dentine and enamel in situ. J. Microbiol. Methods. 81, 166-174 (2010).
- Al-Ahmad, A. Bacterial colonization of enamel in situ investigated using fluorescence in situ hybridization. J. Med. Microbiol. 58, 1359-1366 (2009).
- Bryers, J. D. Medical biofilms. Biotechnol. Bioeng. 100, 1-18 (2008).
- Cardinale, M., Vieira de Castro, J., Muller, H., Berg, G., Grube, M. In situ analysis of the bacterial community associated with the reindeer lichen Cladonia arbuscula reveals predominance of Alphaproteobacteria. FEMS Microbiol. Ecol. 66, 63-71 (2008).
- Aas, J. A., Paster, B. J., Stokes, L. N., Olsen, I., Dewhirst, F. E. Defining the normal bacterial flora of the oral cavity. J. Clin. Microbiol. 43, 5721-5732 (2005).
- Chin, M. Y., Busscher, H. J., Evans, R., Noar, J., Pratten, J. Early biofilm formation and the effects of antimicrobial agents on orthodontic bonding materials in a parallel plate flow chamber. Eur. J. Orthod. 28, 1-7 (2006).
- Loy, A., Maixner, F., Wagner, M., Horn, M. probeBase–an online resource for rRNA-targeted oligonucleotide probes: new features 2007. Nucleic. Acids. Res. 35, (2007).
- Diaz, P. I. Molecular characterization of subject-specific oral microflora during initial colonization of enamel. Appl. Environ. Microbiol. 72, 2837-2848 (2006).
- Dige, I., Nilsson, H., Kilian, M., Nyvad, B. In situ identification of streptococci and other bacteria in initial dental biofilm by confocal laser scanning microscopy and fluorescence in situ hybridization. Eur. J. Oral Sci. 115, 459-467 (2007).
- Kolenbrander, P. E. Bacterial interactions and successions during plaque development. Periodontology. 42, 47-79 (2000).
- Kolenbrander, P. E., Palmer, R. J., Periasamy, S., Jakubovics, N. S. Oral multispecies biofilm development and the key role of cell-cell distance. Nat. Rev. Microbiol. 8, 471-480 (2010).
- Chalmers, N. I. Use of quantum dot luminescent probes to achieve single-cell resolution of human oral bacteria in biofilms. Appl. Environ. Microbiol. 73, 630-636 (2007).
- Wecke, J. A novel technique for monitoring the development of bacterial biofilms in human periodontal pockets. FEMS Microbiol. Lett. 191, 95-101 (2000).
- Moter, A., Gobel, U. B. Fluorescence in situ hybridization (FISH) for direct visualization of microorganisms. J. Microbiol. Methods. 41, 85-112 (2000).
