عن طريق الفم من تحليل بيوفيلم المتوسعون حلقي بواسطة التهجين في الموضع الإسفار ومتحد البؤر المسح الضوئي ليزر مجهرية
Summary
نقدم بروتوكولا للتحليل الهيكلية والتركيبية للبيوفيلم الفم الطبيعية من الأجهزة التقويمية مع<em> في الموقع</em> التهجين (FISH) ومتحد البؤر المجهري مسح الليزر (CLSM). تم جمع عينات من الفم بيوفيلم المتوسع حنكي وتجريف الاكريليك الراتنج ، رقائق قبالة سطحها وإحالتهم للتجهيز الجزيئية.
Abstract
اليوم سهلت مبائر المجهري المسح بواسطة أشعة الليزر (CLSM) من غير المتجانسة بيوفيلم الطبيعية مجموعة شاملة من تقنيات التلوين ، واحد منهم يجري في مضان التهجين الموضع (FISH). 1،2 نحن إجراء الدراسة التجريبية التي جمعت عينات من الفم بيوفيلم الثابتة وكانت ملطخة الأجهزة التقويمية (حنكي المتوسع) من الأسماك ، والهدف من ذلك لتقييم منظمة ثلاثية الأبعاد من بيوفيلم الطبيعية وتراكم الترسبات. 3،4 FISH يخلق فرصة لصبغ الخلايا في بيئتها الأصلية بيوفيلم عن طريق استخدام 16S fluorescently المسمى الرنا الريباسي استهداف تحقيقات. 4-7،19 بالمقارنة مع التقنيات البديلة مثل وضع العلامات مناعي ، وهذا هو غير مكلفة ، تقنية وضع العلامات دقيقة ومباشرة التحقيق في مجموعات بكتيرية مختلفة في اتحادات بيوفيلم مختلطة. 18،20 التحقيقات العامة التي كانت تستخدم لربط Eubacteria ( + + EUB338 EUB338II EUB338III ؛ الآخرة EUBmix) ، 8-10 Firmicutes (LGC354 AC ؛ استخدمت LGCmix الآخرة) ، وBacteroidetes 9،10 (Bac303) 11 بالإضافة إلى ذلك ، تحقيقات محددة وملزمة لالعقدية الطافرة (MUT590) 12،13 وPorphyromonas اللثوية (POGI) 13،14. . صلابة المتطرفة من المواد السطحية المعنية (الفولاذ المقاوم للصدأ وراتنج الأكريليك) أجبرتنا على إيجاد طرق جديدة لإعداد بيوفيلم. كما لا يمكن أن تكون هذه المواد السطحية قطع بسهولة مع مبضع بردي ، واستكشاف أساليب مختلفة للحصول على عينات بيوفيلم الشفوي سليمة. وقدم معظم عملي من هذين النهجين في هذا البلاغ. وكشط رقائق صغيرة من راتنج الأكريليك بيوفيلم الحاملة قبالة مع مشرط معقم ، مع الحرص على عدم الاضرار هيكل بيوفيلم. تم استخدام ملقط لجمع بيوفيلم من الأسطح الفولاذية. جمعها مرة واحدة ، كانت ثابتة العينات ووضعها مباشرة على الشرائح polysine الزجاج المطلي. وقد أجريت هذه الأسماك مباشرة على الشرائح مع تحقيقات مentioned أعلاه. تم الجمع بين مختلف بروتوكولات السمكية وتعديلها لإنشاء البروتوكول الجديد الذي كان من السهل التعامل معها. 5،10،14،15 وبعد ذلك تم تحليل العينات بواسطة الليزر المجهري متحد البؤر المسح الضوئي. ويمكن معروفة تكوينات 3،4،16،17 يمكن تصور ، بما فطر على غرار تشكيلات ومجموعات من البكتيريا المكورة التي عمت القنوات. بالإضافة إلى ذلك ، تم تحليل تركيبة هذه الهياكل البكتيرية بيوفيلم وخلق الصور النمطية 2D و 3D.
Protocol
Discussion
وهنا وصف البروتوكول هو نهج عملي للغاية لتلطيخ الأغشية الحيوية التي تم جمعها من المواد الصلبة. أخذ العينات والتهجين هي الخطوات الأكثر أهمية. خلال المعاينة ، يجب الحرص على جمع شرائح من سمك كافية لضمان أن الهيكل بيوفيلم لا تزال سليمة. خلال التهجين ، فمن الضروري لتجنب التقلبات المفرطة في درجة الحرارة ، وبالتالي تجنب غير محددة وملزمة ، أو فقدان ملزمة ، من تحقيقات fluorescently المسمى. FISH هذا البروتوكول هو أسلوب أنيق وصمة عار على بيوفيلم متجانسة طبيعية مباشرة على الشرائح الزجاجية دون تعطيل تكوينها. ويمكن على الفور الشرائح تستعمل لالمجهري دون الحاجة لنقل العينة مرة أخرى. بهذه الطريقة ، يتم تحقيق تحسن على تلطيخ في أنابيب بالقوة أقل القص يجري تطبيقها على بيوفيلم. يمكن تحضير شرائح> 50 ميكرون سميكة والتحقيق في هذا الشكل.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل فون النظافة من جامعة غراتس الطبية. وقدم جميع الموضوعات علم موافقتهم. تم الحصول على الموافقة المؤسسية لبروتوكول الدراسة من جامعة غراتس الطبية.
Materials
| Oligonucleotides | Target organism | Fluorochrome |
|---|---|---|
| EUB338 – 338III | Eubacteria | Cy3 |
| LGC354 A-C | Firmicutes | FITC |
| Bac303 | Bacteroidetes | Cy5 |
| Mut590 | Streptococcus mutans | FITC |
| POGI | Porphyromonas gingivalis | FITC |
Table 3. Oligonucleotides (refer to probeBase13 for details).
| Component | Company | Comments |
|---|---|---|
| 4% paraformaldehyde | 4% solution in PBS | |
| 1 x PBS | 3 x solution prepared | |
| ddH2O | Millipore | |
| Ethanol (100%) | Merck | |
| Lysozyme | Roth | 100 mg/ml stock solution |
| Formamide | Roth | 99.5% solution |
| 5 M NaCl | Roth | |
| 1 M Tris-HCl | Roth | |
| 2% SDS | Roth | |
| FISH probes (oligonucleotides) | Invitrogen, Sigma | |
| ProLong Gold antifadent | Invitrogen | |
| Nail polish | ||
| Equipment | ||
| Incubator | Thermo Scientific | |
| Water bath | IKA Tez | |
| 50 ml tubes | Sarstedt | |
| Polysine-coated slides | Thermo Scientific |
Table 4. Materials and equipment.
References
- Sunde, P. T. Fluorescence in situ hybridization (FISH) for direct visualization of bacteria in periapical lesions of asymptomatic root-filled teeth. Microbiology. 149, 1095-1102 (2003).
- Sussman, M., Loya, Y., Fine, M., Rosenberg, E. The marine fireworm Hermodice carunculata is a winter reservoir and spring-summer vector for the coral-bleaching pathogen Vibrio shiloi. Environ. Microbiol. 5, 250-255 (2003).
- Kolenbrander, P. E. Communication among oral bacteria. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 66, 486-505 (2002).
- Zijnge, V. Oral biofilm architecture on natural teeth. PLoS One. 5, e9321-e9321 (2010).
- Thurnheer, T., Gmur, R., Giertsen, E., Guggenheim, B. Automated fluorescent in situ hybridization for the specific detection and quantification of oral streptococci in dental plaque. J. Microbiol. Methods. 44, 39-47 (2001).
- Hojo, K., Nagaoka, S., Ohshima, T., Maeda, N. Bacterial interactions in dental biofilm development. J. Dent. Res. 88, 982-990 (2009).
- Jung, D. J. Visualization of initial bacterial colonization on dentine and enamel in situ. J. Microbiol. Methods. 81, 166-174 (2010).
- Al-Ahmad, A. Bacterial colonization of enamel in situ investigated using fluorescence in situ hybridization. J. Med. Microbiol. 58, 1359-1366 (2009).
- Bryers, J. D. Medical biofilms. Biotechnol. Bioeng. 100, 1-18 (2008).
- Cardinale, M., Vieira de Castro, J., Muller, H., Berg, G., Grube, M. In situ analysis of the bacterial community associated with the reindeer lichen Cladonia arbuscula reveals predominance of Alphaproteobacteria. FEMS Microbiol. Ecol. 66, 63-71 (2008).
- Aas, J. A., Paster, B. J., Stokes, L. N., Olsen, I., Dewhirst, F. E. Defining the normal bacterial flora of the oral cavity. J. Clin. Microbiol. 43, 5721-5732 (2005).
- Chin, M. Y., Busscher, H. J., Evans, R., Noar, J., Pratten, J. Early biofilm formation and the effects of antimicrobial agents on orthodontic bonding materials in a parallel plate flow chamber. Eur. J. Orthod. 28, 1-7 (2006).
- Loy, A., Maixner, F., Wagner, M., Horn, M. probeBase–an online resource for rRNA-targeted oligonucleotide probes: new features 2007. Nucleic. Acids. Res. 35, (2007).
- Diaz, P. I. Molecular characterization of subject-specific oral microflora during initial colonization of enamel. Appl. Environ. Microbiol. 72, 2837-2848 (2006).
- Dige, I., Nilsson, H., Kilian, M., Nyvad, B. In situ identification of streptococci and other bacteria in initial dental biofilm by confocal laser scanning microscopy and fluorescence in situ hybridization. Eur. J. Oral Sci. 115, 459-467 (2007).
- Kolenbrander, P. E. Bacterial interactions and successions during plaque development. Periodontology. 42, 47-79 (2000).
- Kolenbrander, P. E., Palmer, R. J., Periasamy, S., Jakubovics, N. S. Oral multispecies biofilm development and the key role of cell-cell distance. Nat. Rev. Microbiol. 8, 471-480 (2010).
- Chalmers, N. I. Use of quantum dot luminescent probes to achieve single-cell resolution of human oral bacteria in biofilms. Appl. Environ. Microbiol. 73, 630-636 (2007).
- Wecke, J. A novel technique for monitoring the development of bacterial biofilms in human periodontal pockets. FEMS Microbiol. Lett. 191, 95-101 (2000).
- Moter, A., Gobel, U. B. Fluorescence in situ hybridization (FISH) for direct visualization of microorganisms. J. Microbiol. Methods. 41, 85-112 (2000).
