Orale Biofilm Analyse van de Palatal Expanders door middel van fluorescentie in-situ hybridisatie en confocale laser scanning microscopie

1. Specimen collectie Verwijder de vaste palatinale expanders na 4 maanden van intraorale service. Gebruik NOLA Droog veld Systeem om de toestellen te isoleren voordat u ze (figuren 1 en 2). Gebruik gesteriliseerde tangen, handschoenen en trays te expanders te verwijderen zonder toevoeging van verontreiniging (figuren 3 en 4). Bewaar objecten in Sarstedt 120 ml flacons bij -20 ° C. Nemen om het laboratorium op het ijs en het proces binnen 24 uur. 2. Biofilm fixatie Schraap biofilm schilfers met een steriele scalpel, of het verzamelen stukken met steriel pincet. Voeg ijskoude 4% PFA-oplossing tot monster wordt goed gedekt. Incubeer dit mengsel bij +4 ° C (niet invriezen) gedurende 3 tot 12 uur. Langere fixatietijden of hogere temperaturen kunnen fixatie maken de cel enveloppen van gram-negatieve cellen minder doorlaatbaar voor oligonucleotideprobes. Verwijder de PFA oplossing en wassen met ijskoud 1X PBS. Herhaal deze stap 2-3 keer aan rerwijderen resterende PFA. Resuspendeer het monster in 1 vol. ijskoud 1X PBS en voeg 1 vol. ijskoude 96% (v / v) ethanol. Bewaar het monster bij -20 ° C. Monsters vastgesteld op basis van dit protocol kan worden opgeslagen voor enkele maanden tot jaren. 3. Uitdroging van vaste monsters Toe te passen 5-30 ul van PFA-vaste monstermateriaal op een objectglaasje. Droog bij 46 ° C voor ongeveer 15 minuten of bij kamertemperatuur langer. Ontdooi de lysozym en de formamide. Voeg 250 ul van lysozym (1mg/ml) bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten, waardoor het gemakkelijker penetratie van de sondes in de cellen door de gedeeltelijke vernietiging van de celwanden. Dip glijden in 50%, 80% en 96% (v / v) ethanol gedurende 3 minuten elk. Het uitdrogend effect van de concentratie ethanol serie zal desintegreren van de celmembranen. Droog de glaasjes op 46 ° C gedurende 10 minuten. 4. In-situ hybridisatie Bereid 1 mlverse hybridisatie buffer (zie tabel 1 voor de concentraties). Formamide concentraties die in deze studie: 10% (EUBmix), 20% (Bac303, POGI, MUT590) of 45% (LGCmix). Ontdooi de oligonucleotide probe-oplossingen. Ontdooide sondes worden bewaard op ijs en beschermd tegen licht. Voeg 2 pi van elke probe tot 200 ul van hybridisatie buffer, goed mengen en breng het mengsel op de gedroogde monster op een microscoopglaasje. Leg een stukje weefsel papier in een vierkant petrischaal en giet de rest van hybridisatie buffer op het weefsel papier. Onmiddellijk horizontaal plaatsen van de dia in de schotel en sluit de schotel. Incubeer in een oven op 46 ° C voor 1-5 uur (90 min volstaan ​​in de meeste gevallen). De schotel fungeert als een vocht kamer het voorkomen van verdamping van hybridisatie-oplossing uit de dia. In het bijzonder kan de verdamping van formamide oorzaak niet-specifieke probe binding aan non-target cellen. Bereid 50 ml wasbuffer (zie tabel 2 voor concentrations). Bereid de wasbuffer in een 50 ml buis en verwarm tot 48 ° C in een waterbad. De wasstap wordt uitgevoerd bij 48 ° C. Haal de schotel met de dia in de hybridisatie oven. Onmiddellijk wassen uit de hybridisatie buffer met een klein volume van de voorverwarmde wasbuffer, en breng de dia in de resterende wasbuffer. Plaats de buis met het wassen buffer en de schuif terug in het waterbad en incubeer bij 48 ° C gedurende 10-15 minuten. Verwijder dia uit de tube en dip in de ijskoude DDH 2 O voor 2-3 seconden om de resterende wasbuffer te elimineren. De lucht drogen de schuif zo snel mogelijk (het gebruik van perslucht wordt aanbevolen). Sneldrogende zal verminderen sonde dissociatie. Gedroogde dia's kunnen worden opgeslagen in het donker bij -20 ° C gedurende enkele weken zonder een significant verlies van de probe-verleende fluorescentie-signaal. 5. Microscopie Na het FISH en wassen, apply twee druppels antifadent de buurt van de linker-en rechterzijde van een dia (bevroren plakjes moet worden opgewarmd tot kamertemperatuur voorafgaand aan deze stap). Plaats een microscoop dekglas op de top en wacht tot de antifadent heeft verspreid over de hele dia. Merk op dat een overmatige hoeveelheid antifadent kan de microscoop beeld vervagen. Let op de monsters onder een confocale laser scanning microscoop uitgerust met geschikte filters of lasers. We gebruikten een Leica TCS unit (HCX PL APO/63x; NA 1.2). Gegevens kunnen worden geanalyseerd met software zoals IMARIS of AMIRA. Dia's zijn ingebed in antifadent kan worden opgeslagen bij +4 ° C (niet invriezen) tot 7 dagen voor de probe-verleende fluorescentie begint te dalen. Als alternatief kan de antifadent worden verwijderd met DDH 2 O, en de gedroogde dia's kunnen worden opgeslagen bij -20 ° C voor een langere periode van tijd. 6. Representatieve resultaten: Schrapen biofilm off vaste orthodontische apparatuur (Figuur 5) geeft geschikt vlokken (Figuur 6), die direct kan worden gehybridiseerd op gecoat glas dia's voor microscopie. Op deze manier kunnen verschillende groepen orobiome bacteriën geïdentificeerd worden in hun natuurlijke driedimensionale omgeving door tagging bacteriële rRNA met verschillend gelabelde specifieke probes (figuren 7 en 8). In figuur 7 is biofilm gekleurd met EUBmix (groen, alle bacteriën) en LGCmix (geel, Firmicutes). Firmicutes in het groen, als ze waren gekleurd met geel en blauw. In Figuur 8, werd biofilm gekleurd met EUBmix (rood, alle bacteriën), Bac303 (blauw, Bacteroidetes) en POGI (geel, Porphyromonas gingivalis). Porphyromonas gingivalis wordt weergegeven in geelachtig wit, omdat alle drie probes binden aan het DNA en de overlap van kleuren resulteert in een wit signaal. Morfologische verschillen tussen groepen van bacteriën kunnen ook worden geïdentificeerd (figuren 9 en 10). Grote clusters van coccoid bacteriën zijn weergegeven in Figuur 9, waar de kleuring werd uitgevoerd met EUBmix (groen, alle bacteria). Verschillende vormen van orale bacteriën werden gevisualiseerd in figuur 10, waar coccoid en filamenteuze bacteriën kunnen worden onderscheiden door kleuring met EUBmix (rood). Ook een typische paddestoel-achtige structuur van de biofilm kan worden verwerkt via de 3D-modellering van de CLSM gegevens (figuren 11 en 12) Klik hier voor een filmpje van de 3D-modellering te kijken. Figuur 1. Fixed palatinale expander in situ. Figuur 2. Nola Droog Field System. Figuur 3. Gesteriliseerde tangen, handschoenen en een lade. Figuur 4. Verwijderde expander. Figuur 5. Afschrapen biofilm met een steriel scalpel. Figuur 6. Resin vlokken direct gehybridiseerd op gecoat glas dia's. Figuur 7 CLSM afbeelding:. Differentiatie van een specifieke bacteriële groep. 2D-overlay van 3D CLSM stack gegevens. Biofilm gekleurd met EUBmix (groen, alle bacteriën) en LGCmix (geel, Firmicutes). Figuur 8 CLSM afbeelding:. Differentiatie van een specifieke bacteriële groep. 2D-overlay van 3D CLSM stack gegevens. Biofilm gekleurd met EUBmix (rood, alle bacteriën), Bac303 (blauw, Bacteroidetes) en POGI (geel, Porphyromonas gingivalis). Figuur 9 CLSM afbeelding:. Differentiatie van specifieke morfologiën. 2D-overlay van 3D CLSM stack gegevens. Biofilm gekleurd met EUBmix (groen, alle bacteriën). Grote clusters van coccoid bacteriën (pijlen). . Figuur 10 CLSM foto's: differentiatie van specifieke morfologiën. 2D-overlay van 3D CLSM stack gegevens. Biofilm gekleurd met EUBmix (rood, alle bacteriën). Coccoid (pijl hieronder) en filamenteuze bacteriën (pijl boven) kan worden onderscheiden. Figuur 11. Mushroom structuur, 3D-weergave van onderen. Stapels van biofilm vlokken (afgeschraapt het oppervlak van een orthodontische toestel), gekleurd met EUBmix en proceduresssed met IMARIS (CLSM beeld). Figuur 12. Mushroom structuur, 3D-zijaanzicht. Stapels van biofilm vlokken (afgeschraapt het oppervlak van een orthodontische toestel) verwerkt met IMARIS (CLSM beeld). Hybridisatiebuffer (200 pi) Formamide concentratie 10% 20% 45% 5 M NaCl 36 36 36 1 M Tris-HCl 4 4 4 2% SDS 1 1 1 FA 20 40 90 <strong> DDH 2 O 138 118 68 Elke FISH probe 2 2 2 Tabel 1. Bestanddelen van hybridisatie buffer (concentraties in pi). Wassen buffer (50 ml) Formamide concentratie 10% 20% 45% 5 M NaCl 4500 2150 300 1 M Tris-HCl 1000 1000 1000 0,5 M EDTA 0 500 500 DDH 2 O 44 500 46 350 </td> 48 200 Tabel 2. Bestanddelen van wasbuffer (concentraties in pi). Film 1. Klik hier om de film te bekijken.