Analyse orale de biofilm palatine Expandeurs par fluorescence hybridation in situ et la microscopie confocale à balayage laser

1. Prélèvement Retirer fixes palatine expandeurs après 4 mois de service intra-buccale. Utilisation du système NOLA terrain sec pour isoler les appareils avant leur suppression (figures 1 et 2). Utilisez des pinces stérilisées, des gants et des plateaux pour enlever expandeurs sans ajouter la contamination (figures 3 et 4). Objets magasin dans des flacons de 120 ml Sarstedt à -20 ° C. Prenez au laboratoire sur de la glace et le processus dans les 24 heures. 2. Fixation du biofilm Grattez flocons biofilm avec un scalpel stérile, ou de recueillir des pièces avec des pinces stériles. Ajouter une solution glacée de 4% jusqu'en PFA échantillon est bien couvert. Incuber le mélange à 4 ° C (ne pas congeler) pour 3 à 12 heures. Temps de fixation plus longues ou à des températures supérieures de fixation peut rendre les enveloppes cellulaires des bactéries gram-négatives cellules moins perméable aux sondes oligonucléotidiques. Retirer solution de PFA et laver avec glacée PBS 1X. Répétez cette étape 2-3 fois à reMove résiduelle PFA. Resuspendre l'échantillon en 1 vol. glacée PBS 1X et ajouter 1 vol. glacée 96% (v / v) d'éthanol. Conserver l'échantillon à -20 ° C. Les échantillons fixés en fonction de ce protocole peuvent être stockés pendant plusieurs mois à plusieurs années. 3. La déshydratation des échantillons fixés Appliquer ul 50-30 du PFA matériel fixé l'échantillon sur une lame de microscope. Sec à 46 ° C pendant environ 15 min ou à température ambiante pendant plus longtemps. Décongeler le lysozyme et la formamide. Ajouter 250 pi de lysozyme (1mg/ml) à température ambiante pendant 10 min, facilitant ainsi la pénétration des sondes dans les cellules par une destruction partielle des parois cellulaires. Trempez glisser dans 50%, 80% et 96% (v / v) d'éthanol pendant 3 min chacune. L'effet diurétique de la série concentration d'éthanol va se désintégrer les membranes cellulaires. Sécher les lames à 46 ° C pendant 10 min. 4. Hybridation in situ Préparer 1 ml detampon d'hybridation douce (voir le tableau 1 pour les concentrations). Le formamide concentrations utilisées dans cette étude: 10% (EUBmix), 20% (Bac303, POGI, MUT590) ou 45% (LGCmix). Décongeler les solutions de sondes oligonucléotidiques. Sondes décongelés doivent être conservés sur la glace et protégé de la lumière. Ajouter 2 ul de chaque sonde à 200 pi de tampon d'hybridation, bien mélanger et appliquer le mélange à l'échantillon déshydraté sur une lame de microscope. Placez un morceau de papier de soie dans un plat carré de Pétri et versez le tampon d'hybridation reste sur le papier de soie. Immédiatement placer la lame à l'horizontale dans le plat et fermer le plat. Incuber dans un four à 46 ° C pendant 1-5 heures (90 min suffiront dans la plupart des cas). Les fonctions plat comme une chambre de l'humidité empêchant l'évaporation de la solution d'hybridation de la diapositive. En particulier, l'évaporation de formamide peut provoquer non spécifiques se liant à la sonde cellules non cibles. Préparer 50 ml de tampon de lavage (voir Tableau 2 pour concentrations). Préparer le tampon de lavage dans un tube de 50 ml et préchauffer à 48 ° C dans un bain d'eau. L'étape de lavage est effectué à 48 ° C. Retirer le plat avec la lame du four d'hybridation. Laver immédiatement le tampon d'hybridation avec un petit volume de tampon de lavage pré-chauffé, et le transfert de la glisser dans le tampon de lavage restant. Placer le tube contenant le tampon de lavage et de la glisser dans le bain d'eau et incuber à 48 ° C pendant 10-15 min. Retirer glisser dans le tube et plonger dans la glace froide O ddH 2 pour 2-3 secondes pour éliminer les résidus de tampon de lavage. Sécher à l'air de la diapositive aussi rapidement que possible (l'utilisation d'air comprimé est recommandé). Séchage rapide permettra de réduire la sonde de dissociation. Diapositives séchées peuvent être stockés dans l'obscurité à -20 ° C pendant plusieurs semaines sans perte significative de sonde conféré signal de fluorescence. 5. Microscopie Après FISH et le lavage, apply deux gouttes de près antifadent les extrémités gauche et droite d'une diapositive (tranches congelé doit être réchauffé à la température ambiante avant cette étape). Placez un couvercle sur le dessus de glissement de microscope et attendre que le antifadent s'est répandu sur la lame entière. Notez qu'une quantité excessive de antifadent peuvent brouiller l'image du microscope. Observez les échantillons sous un microscope confocal à balayage laser équipé de filtres appropriés ou des lasers. Nous avons utilisé un Leica TCS unité (HCX PL APO/63x; NA 1.2). Les données peuvent être analysées avec un logiciel tel que Imaris ou Amira. Diapositives intégrées dans antifadent peuvent être conservés à 4 ° C (ne pas congeler) jusqu'à 7 jours avant la sonde de fluorescence conféré commence à diminuer. Alternativement, le antifadent peuvent être enlevés avec ddH 2 O, et les lames séchées peuvent être conservées à -20 ° C pour une période de temps prolongée. 6. Les résultats représentatifs: Grattage biofilm hors appareils orthodontiques fixes (Figure 5) de flocons de rendements adéquats (figure 6) qui peuvent être hybridées directement sur lames de verre recouvertes de microscopie. De cette façon, les différents groupes de bactéries orobiome peuvent être identifiés dans leur milieu naturel en trois dimensions environnement en marquage ARNr bactériens étiquetés différemment des sondes spécifiques (figures 7 et 8). Dans la figure 7, le biofilm était tachée de EUBmix (vert, toutes les bactéries) et LGCmix (jaune, Firmicutes). Firmicutes apparaissent en vert, comme ils ont été colorés avec du jaune et du bleu. Dans la figure 8, le biofilm était tachée de EUBmix (rouge, toutes les bactéries), Bac303 (bleu, Bacteroidetes) et POGI (jaune, Porphyromonas gingivalis). Porphyromonas gingivalis est montré dans blanc jaunâtre, comme tous les trois sondes se lient à l'ADN et le chevauchement des résultats de couleurs dans un signal blanc. Les différences morphologiques entre les groupes de bactéries peuvent également être identifiés (figures 9 et 10). Grands groupes de bactéries coccoïdes sont présentés dans la figure 9, où la coloration a été réalisée avec EUBmix (vert, tous les bacteria). Différentes formes de bactéries orales ont été visualisées dans la figure 10, où les bactéries coccoïdes et filamenteuses peuvent être distingués par coloration avec EUBmix (rouge). En outre, un type de champignon comme la structure du biofilm peut être traitée via la modélisation 3D des données CLSM (figures 11 et 12) Cliquez ici pour regarder un film de la modélisation 3D. Figure 1. Correction d'extension palatine in situ. Figure 2. Système de Nola terrain sec. Figure 3. Stérilisé pinces, des gants et un plateau. Figure 4. Suppression d'extension. Figure 5. Grattage biofilm avec un scalpel stérile. Flocons de résine figure 6. Directement hybridés sur des lames de verre enduit. Figure 7 Image CLSM:. Différenciation d'un groupe spécifique de bactéries. Superposition de données 2D 3D pile CLSM. Biofilm colorés avec EUBmix (vert, toutes les bactéries) et LGCmix (jaune, Firmicutes). Figure 8 images CLSM:. Différenciation d'un groupe spécifique de bactéries. Superposition de données 2D 3D pile CLSM. Tachés biofilm avec EUBmix (rouge, toutes les bactéries), Bac303 (bleu, Bacteroidetes) et POGI (jaune, Porphyromonas gingivalis). Figure 9 images CLSM:. Différenciation des morphologies particulières. Superposition de données 2D 3D pile CLSM. Biofilm colorés avec EUBmix (vert, toutes les bactéries). Grands groupes de bactéries coccoïdes (flèches). Images CLSM Figure 10:. Différenciation des morphologies particulières. Superposition de données 2D 3D pile CLSM. Biofilm colorés avec EUBmix (rouge, toutes les bactéries). Coccoïde (flèche bas) et des bactéries filamenteuses (flèche haut) peuvent être distingués. Structure de champignons Figure 11., Vues 3D à partir de ci-dessous. Piles de flocons de biofilm (gratté la surface d'un appareil orthodontique), colorées avec EUBmix et procéduresSSED avec Imaris (image CLSM). Structure de champignons Figure 12., Vue de côté 3D. Piles de flocons de biofilm (gratté la surface d'un appareil orthodontique) traitées avec Imaris (image CLSM). Tampon d'hybridation (200 pi) Concentration de formamide 10% 20% 45% 5 M de NaCl 36 36 36 1 M Tris-HCl 4 4 4 2% de SDS 1 1 1 FA 20 40 90 <strong> DdH 2 O 138 118 68 Toute sonde FISH 2 2 2 Constituants Tableau 1. De tampon d'hybridation (concentrations en pl). Tampon de lavage (50 ml) Concentration de formamide 10% 20% 45% 5 M de NaCl 4500 2150 300 1 M Tris-HCl 1000 1000 1000 EDTA 0,5 M 0 500 500 ddH 2 O 44 500 46 350 </td> 48 200 Constituants Tableau 2. De tampon de lavage (concentrations en pl). Vidéo 1. Cliquez ici pour regarder le film.