Oral Biofilm Analyse Palatal Expander durch Fluoreszenz in situ Hybridisierung und konfokale Laser Scanning Mikroskopie
Summary
Wir präsentieren ein Protokoll für die strukturelle und Analyse der Zusammensetzung der natürlichen oralen Biofilm aus kieferorthopädischen Apparaturen mit<em> In situ</em> Hybridisierung (FISH) und konfokale Laser Scanning Mikroskopie (CLSM). Oral Biofilm-Proben wurden von palatinal Expander gesammelt, Schaben Acrylharz-abplatzt ihrer Oberfläche und deren Weiterleitung für die molekulare Verarbeitung.
Abstract
Konfokale Laser Scanning Mikroskopie (CLSM) der natürlichen heterogenen Biofilm ist heute durch ein umfassendes Angebot an Färbetechniken, von denen einer Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) erleichtert. 1,2 Wir haben eine Pilotstudie, in der mündlichen Biofilm Proben aus festen gesammelt wurden, kieferorthopädischen Apparaturen (palatinale Expander) wurden durch FISH mit dem Ziel, die dreidimensionale Organisation der natürlichen Biofilm und Plaque zu beurteilen gefärbt. 3,4 FISH schafft eine Gelegenheit, um Zellen in ihrer Muttersprache Biofilm-Umgebung Fleck durch die Verwendung von fluoreszenzmarkierten 16S rRNA-Targeting-Sonden. 4-7,19 Im Vergleich zu alternativen Techniken wie Immunfluoreszenz Kennzeichnung, ist dies eine kostengünstige, präzise und einfache Kennzeichnung Technik, um verschiedene bakterielle Gruppen in gemischten Biofilm Konsortien zu untersuchen. 18,20 Allgemeine Sonden verwendet wurden, die Bindung an Eubakterien ( EUB338 + + EUB338II EUB338III; nachfolgend EUBmix), 8-10 Firmicutes (LGC354 AC;. Wurden nachfolgend LGCmix), 9,10 und Bacteroidetes (Bac303) 11 Darüber hinaus spezifische Sonden Bindung an Streptococcus mutans (MUT590) 12,13 und Porphyromonas gingivalis (POGI) 13,14 verwendet . Die extreme Härte der Oberfläche beteiligten Materialien (Edelstahl und Acryl) zwang uns, neue Wege zur Herstellung des Biofilms zu finden. Da diese Oberflächen-Materialien könnten nicht ohne weiteres mit einem Kryotom geschnitten werden, wurden verschiedene Methoden zur Probenahme untersucht werden, um intakte orale Biofilm zu erhalten. Die meisten praktikable dieser Ansätze ist in dieser Mitteilung vorgestellt. Kleine Flocken des Biofilms tragenden Acrylharz wurden mit einem sterilen Skalpell abgekratzt, kümmert sich nicht um den Biofilm-Struktur beschädigen. Pinzetten wurden verwendet, um Biofilm aus dem Stahl-Oberflächen zu sammeln. Einmal gesammelt, wurden die Proben fixiert und direkt auf Polysine beschichteten Glasplättchen gelegt. FISH wurde direkt auf diese Folien mit den Sonden m durchgeführtentioned oben. Verschiedene FISH-Protokolle wurden kombiniert und modifiziert werden, um ein neues Protokoll, das einfach zu handhaben war zu schaffen. 5,10,14,15 Anschließend werden die Proben mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie analysiert. Namhafte Konfigurationen 3,4,16,17 visualisiert werden, einschließlich Pilz-style-Formationen und Gruppen von Kokken durch Kanäle durchzogen. Darüber hinaus wurden die bakterielle Zusammensetzung dieser typischen Biofilm Strukturen analysiert und 2D-und 3D-Bilder erstellt.
Protocol
Discussion
Das Protokoll beschrieben ist eine sehr praktikable Ansatz zur Färbung Biofilme aus harten Materialien gesammelt. Sampling und Hybridisierung sind die wichtigsten Schritte. Bei der Probenahme ist darauf zu achten, dass Scheiben von ausreichender Dicke gesammelt werden, um sicherzustellen, dass der Biofilm-Struktur intakt bleibt. Während der Hybridisierung ist es wichtig, starken Temperaturschwankungen zu vermeiden, wodurch die unspezifische Bindung oder Verlust der Bindung, der fluoreszenzmarkierten Sonden. Diese FISH-Protokoll ist eine elegante Methode zur normalen heterogenen Biofilm direkt auf Glas-Objektträger Fleck ohne Unterbrechung seiner Zusammensetzung. Die Folien können sofort für die Mikroskopie, ohne die Notwendigkeit, die Probe erneut verschieben werden. Auf diese Weise ist eine Verbesserung gegenüber Färbung in Röhren von weniger Querkraft wird, um den Biofilm aufgebracht werden. Slices> 50 um dicke vorbereitet und auf diese Weise untersucht werden.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der Hygiene Fonds der Medizinischen Universität Graz unterstützt. Alle Probanden gaben ihre Einwilligung. Institutionelle Zustimmung des Studienprotokoll wurde von der Medizinischen Universität Graz erhalten.
Materials
| Oligonucleotides | Target organism | Fluorochrome |
|---|---|---|
| EUB338 – 338III | Eubacteria | Cy3 |
| LGC354 A-C | Firmicutes | FITC |
| Bac303 | Bacteroidetes | Cy5 |
| Mut590 | Streptococcus mutans | FITC |
| POGI | Porphyromonas gingivalis | FITC |
Table 3. Oligonucleotides (refer to probeBase13 for details).
| Component | Company | Comments |
|---|---|---|
| 4% paraformaldehyde | 4% solution in PBS | |
| 1 x PBS | 3 x solution prepared | |
| ddH2O | Millipore | |
| Ethanol (100%) | Merck | |
| Lysozyme | Roth | 100 mg/ml stock solution |
| Formamide | Roth | 99.5% solution |
| 5 M NaCl | Roth | |
| 1 M Tris-HCl | Roth | |
| 2% SDS | Roth | |
| FISH probes (oligonucleotides) | Invitrogen, Sigma | |
| ProLong Gold antifadent | Invitrogen | |
| Nail polish | ||
| Equipment | ||
| Incubator | Thermo Scientific | |
| Water bath | IKA Tez | |
| 50 ml tubes | Sarstedt | |
| Polysine-coated slides | Thermo Scientific |
Table 4. Materials and equipment.
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