Análise de biofilme oral de Palatal Expansores por fluorescência de hibridização in situ e microscopia confocal a laser Scanning

1. Coleta de amostras Remover fixa palatal expansores após 4 meses de serviço intra-oral. Use NOLA Sistema de campo seco para isolar os aparelhos antes de removê-los (Figuras 1 e 2). Use um alicate esterilizado, luvas e bandejas para remover expansores sem adição de contaminação (Figuras 3 e 4). Armazenar objetos em Sarstedt 120 ml frascos a -20 ° C. Leve para o laboratório em gelo e processo no prazo de 24 horas. 2. Fixação de biofilme Raspe biofilme flocos com um bisturi estéril, ou coletar peças com pinças esterilizadas. Adicionar gelada 4% solução de PFA até amostra é bem cobertos. Incubar a mistura a +4 ° C (não congelar) durante 3 a 12 horas. Vezes maior fixação ou temperaturas mais altas de fixação pode tornar a célula de envelopes gram-negativas células menos permeável a sondas de oligonucleotídeo. Remoção da solução de PFA e lave com gelado 1X PBS. Repita este passo 2-3 vezes ao remove PFA residual. Ressuspender a amostra em 1 vol. gelada 1X PBS e adicionar 1 vol. gelada-96% (v / v) de etanol. Conservar a amostra a -20 ° C. Amostras fixadas de acordo com este protocolo pode ser armazenado por vários meses a anos. 3. Desidratação das amostras fixas Aplicar mL 50-30 de PFA fixa material de amostra para uma lâmina de microscópio. Seco a 46 ° C por cerca de 15 min ou em temperatura ambiente por mais tempo. Descongele a lisozima ea formamida. Adicionar 250 mL de lisozima (1mg/ml) em temperatura ambiente por 10 min, facilitando assim a penetração das sondas nas células por destruição parcial das paredes celulares. Dip slides em 50%, 80% e 96% (v / v) de etanol por 3 min cada. O efeito desidratante da série concentração de etanol irão se desintegrar as membranas celulares. Secar as lâminas a 46 ° C por 10 min. 4. Hibridização in situ Prepare 1 ml detampão de hibridação fresco (ver Tabela 1 para as concentrações). Formamida concentrações utilizadas neste estudo: 10% (EUBmix), 20% (Bac303, IGP, MUT590) ou 45% (LGCmix). Descongele as soluções sonda de oligonucleotídeos. Sondas descongelados devem ser mantidos em gelo e protegido da luz. Adicionar 2 mL de cada sonda a 200 mL de tampão de hibridação, misture bem e aplique a mistura para a amostra desidratada em uma lâmina de microscópio. Coloque um pedaço de papel de tecido em uma placa de Petri quadrados e despeje o tampão de hibridação restantes para o papel de seda. Colocar imediatamente a lâmina horizontalmente no prato e fechar o prato. Incubar em estufa a 46 ° C por 1-5 horas (90 min será suficiente na maioria dos casos). As funções prato como uma câmara de umidade evitando a evaporação da solução de hibridização do slide. Em particular, a evaporação de formamida pode causar não-específica sonda ligação a células não-alvo. Prepare 50 ml de tampão de lavagem (ver Tabela 2 para concentrations). Prepare a solução de lavagem em um tubo de 50 ml e pré-aquecimento a 48 ° C em banho-maria. A etapa de lavagem é realizada a 48 ° C. Retire o prato com a lâmina do forno de hibridização. Lave imediatamente o tampão de hibridação com um pequeno volume de pré-aquecido tampão de lavagem, e transferir o deslizar para dentro do tampão de lavagem restante. Colocar o tubo contendo a solução de lavagem eo slide volta para o banho de água e incubar a 48 ° C por 10-15 min. Remover slide do tubo e mergulhar gelada DDH 2 O por 2-3 segundos para eliminar a tampão de lavagem residual. De ar seco a lâmina o mais rápido possível (o uso do ar comprimido é recomendado). Secagem rápida vai reduzir sonda dissociação. Slides secas podem ser armazenadas no escuro a -20 ° C por várias semanas sem perda significativa de sonda-conferidos sinal de fluorescência. 5. Microscopia Depois de FISH e lavagem, apply duas gotas de perto antifadent para as extremidades esquerda e direita de um slide (fatias congelado deve ser aquecido à temperatura ambiente antes de esta etapa). Coloque uma tampa microscópio escorregar em cima e espere até que o antifadent se espalhou por todo o slide. Note-se que uma quantidade excessiva de antifadent podem borrar a imagem de microscópio. Observe as amostras sob um microscópio confocal de varredura a laser equipado com filtros adequados ou lasers. Nós usamos uma Leica TCS unidade (HCX PL APO/63x; NA 1.2). Os dados podem ser analisados ​​com software, tais como IMARIS ou AMIRA. Slides embutidos em antifadent podem ser armazenados a +4 ° C (não congelar) por até 7 dias antes da sonda de fluorescência conferidos começa a declinar. Alternativamente, o antifadent pode ser removido com DDH 2 O, e as lâminas secas podem ser armazenadas a -20 ° C por um período prolongado de tempo. 6. Resultados representativos: Raspagem biofilme off aparelhos ortodônticos fixos (Figura 5) produz flocos adequado (Figura 6) que pode ser hibridizado diretamente sobre lâminas de vidro revestidas de microscopia. Desta forma, diferentes grupos de bactérias orobiome podem ser identificadas no seu ambiente tridimensional natural por rRNA marcação bacteriana com diferentes sondas marcadas específicas (Figuras 7 e 8). Na Figura 7, o biofilme foi corado com EUBmix (verde, todas as bactérias) e LGCmix (amarelo, Firmicutes). Firmicutes aparecem em verde, como eles foram coradas com amarelo e azul. Na Figura 8, o biofilme foi corado com EUBmix (vermelho, todas as bactérias), Bac303 (azul, Bacteroidetes) e IGP (amarelo, Porphyromonas gingivalis). Porphyromonas gingivalis é mostrado em branco amarelado, como todos os três sondas se ligam ao seu DNA e da sobreposição de cores resulta em um sinal branco. Diferenças morfológicas entre os grupos de bactérias também podem ser identificados (Figuras 9 e 10). Grandes aglomerados de bactérias cocóide são mostrados na Figura 9, onde a coloração foi realizada com EUBmix (verde, todos os bacteria). Formas diferentes de bactérias orais foram visualizados na Figura 10, onde as bactérias filamentosas cocóide e podem ser distinguidos pela coloração com EUBmix (vermelho). Além disso, uma estrutura em forma de cogumelo típico do biofilme pode ser processado através de modelagem em 3D dos dados CLSM (figuras 11 e 12) Clique aqui para assistir a um filme da modelagem 3D. Figura 1. Fixed expansor palatal in situ. Figura 2. Nola Sistema de campo seco. Figura 3. Esterilizado alicates, luvas e bandeja. Figura 4. Removido expansor. Figura 5. Scraping off biofilme com um bisturi estéril. Flocos de resina Figura 6. Diretamente hibridizado em lâminas de vidro revestido. Figura 7 imagem CLSM:. Diferenciação de um grupo específico de bactérias. Sobreposição de dados 2D em 3D CLSM pilha. Biofilme corado com EUBmix (verde, todas as bactérias) e LGCmix (amarelo, Firmicutes). Figura 8 imagem CLSM:. Diferenciação de um grupo específico de bactérias. Sobreposição de dados 2D em 3D CLSM pilha. Manchada com biofilme EUBmix (vermelho, todas as bactérias), Bac303 (azul, Bacteroidetes) e IGP (amarelo, Porphyromonas gingivalis). Figura 9 imagem CLSM:. Diferenciação de morfologias específicas. Sobreposição de dados 2D em 3D CLSM pilha. Biofilme corado com EUBmix (verde, todas as bactérias). Grandes aglomerados de bactérias cocóide (setas). . Figura 10 imagens CLSM: diferenciação de morfologias específicas. Sobreposição de dados 2D em 3D CLSM pilha. Biofilme corado com EUBmix (vermelho, todas as bactérias). Cocóide (seta abaixo) e bactérias filamentosas (seta acima) podem ser distinguidas. Figura 11. Mushroom estrutura, vistas 3D a partir de baixo. Pilhas de biofilme flocos (raspado a superfície de um aparelho ortodôntico), coradas com EUBmix e procedimentosssed com IMARIS (imagem CLSM). Figura 12. Mushroom estrutura, vista lateral 3D. Pilhas de biofilme flocos (raspado a superfície de um aparelho ortodôntico) processados ​​com IMARIS (imagem CLSM). Tampão de hibridação (200 mL) Concentração de formamida 10% 20% 45% 5 M NaCl 36 36 36 1 M Tris-HCl 4 4 4 2% SDS 1 1 1 FA 20 40 90 <strong> DDH 2 O 138 118 68 Qualquer sonda FISH 2 2 2 Tabela 1. Constituintes de tampão de hibridação (concentrações em mL). Tampão de lavagem (50 ml) Concentração de formamida 10% 20% 45% 5 M NaCl 4500 2150 300 1 M Tris-HCl 1000 1000 1000 0,5 M EDTA 0 500 500 2 O DDH 44 500 46 350 </td> 48 200 Tabela 2. Constituintes de tampão de lavagem (concentrações em mL). Movie 1. Clique aqui para assistir o filme.