Kemirgen Beyin Dilimleri Nöronlar Vibrodissociation Sinaptik İletim ve Görüntü Presinaptik Terminalleri Eğitim

1. Hazırlanması Alev Sızdırmaz Cam Mikropipet Mikroelektrot cam kullanarak, Flaming-Brown ya da eşdeğer bir mikropipet çektirmesi (ucu çapı ~ 2 mm) standart bir yama klemp mikropipet çekin. Yeri mikropipet ~ 2 saniye boyunca erimiş top kıvamına gelinceye kadar 200-300 mikron çapında bir Bunsen beki alev ucu. Piezoelektrik bimorph, röle veya eşdeğer etkili cihaz kullanarak hızlı bir şekilde (seyahat mesafesi 100-200 mikron) yan-yan titreşilecek bir mikromanipülatör tutucu üzerine yerleştirin alev sızdırmaz yama pipet. 2. P1-P21 Sıçanlar ya da Fare Beyin Dilimleri hazırlanması 124 NaCl, 4.5 KCl, 1.2 NaH 2 NaHCO 3 PO 4, 26 ve 10 D-glukoz: Aşağıdaki kompozisyonu (mM) ile yapay beyin omurilik sıvısı (aCSF) hazırlayın. ~ 15 dakika süreyle% 95 oksijen /% 5 CO 2 gaz Bubble çözümü, daha sonra 2 mM CaCl 2 ve 1 mM MgCl 2 ekleyin. Kesme beyin kesitleri: Halotan ve izofluran ile hayvan anestezisi. Hayvan başını kesmek – beyin kaldırmak istenilen açıda (koronal parasagital, enine, vb) blok beyin ilgi bölgesini de dahil etmek. Yapıştırmayın aCSF batmış bir titreşimli beyin dilimleyiciyi aşamasında bloke beyin 250-400 mikron kalınlığında bölümünde beyin – aCSF dilimler tüm yüzeylerde sıvı / gaz maruziyeti sağlar file "preinkübasyon" odasına carbogen ile kabarmış dilimleri, bu ortamda en az bir saat gelmesini sağlayınız. 3. Vibrodissociation Ve NaOH 150 NaCl, 5 KCl, 10 Hepes, 1 MgCl 2, 2.5 CaCl 2, 10, pH 7.4 'e ayarlanmış olan D-glukoz: Aşağıdaki kompozisyonu (mM) Hepes-tamponlu salin solüsyonu ile 35 mm çap kültür kaplarına doldurun ozmolarite ~ 300 mOsm sakaroz kullanılarak ayarlanabilir. Kültür yemekleri süspansiyon yemekleri, standart hücre kültürü yemekleri, cam lamel ekler ile kültür kaplarına veya yemekler çanak alt güçlü hücre bağlılık için ihtiyaç bağlı olarak, örneğin, poli-L-lizin ile kaplı olabilir. Dilim kültür çanak yerleştirin ve 250 x. bir diseksiyon Stereoskop ile görselleştirmek Dilim dilim üst yüzeyine yerleştirilen bir ağırlık olarak hareket etmek bükük bir platin tel (0,5 mm çap) kullanarak alt tutun. Istenen beyin bölgesi dilim yüzeyinde alev sızdırmaz mikropipet ucu yerleştirin. Gezi mesafe ~ 100 mm, 10-30 Hz'de yanal ucu titreşmeye mikromanipülatör etkinleştirin. Mikromanipülatör kullanarak, ~ 30 saniye içinde tüm dilim geçtiği gibi dilim doku derinliklerine ucu hareket ettirin. Verilen bir beyin bölgesi elde izole nöronların sayısını en üst düzeye çıkarmak için gerekli olan bu adımı yineleyin. Dilim ucu Kaldır – dilim forseps ile pick up ve hala bir çözüm ise yavaşça sallayın sonra tamamen dilim çıkarın ve atın. Ayrışmış hücreleri en az 10 dakika boyunca çanak alt uymak ve yerleşmek için izin verin. 4. Elektrofizyolojik Kayıt Ters bir mikroskop sahnede nöron içeren çanak yerleştirin ve 10 x 63 x objektif ile görselleştirmek. Düzgün bir patent membran, hiçbir blebbing ve algılanabilir ama büyük boyutlu değil çekirdeği ile nöronlar için bakın. Faz kontrast optik kullanılması durumunda da mavi değil, sarımsı-belirti ile faz-parlak nöronlar için. Istenen tuzlar, besinler, reseptör antagonistleri içeren ekstrasellüler çözümü ile Superfuse hücreleri, vb (standart yukarıda belirtilen Hepes-tamponlu salin (bkz. bölüm 3.1)), genellikle 5 mcM 2,3-dioxo-6-nitro-1 ile desteklenmiş 2,3,4-tetrahidrobenzo hızlı GABA izolasyonu sağlar inotropik glutamat reseptörleri bloke [f] quinoxaline-7-sülfonamid disodyum (NBQX) ve 25-100 mcM D-2-amino-5-phosphonopentanoic asit (AP5) reseptör-aracılı IPSCs 1,2. Flaming-Brown veya eşdeğer çektirmenin kullanarak standart bir yama mikropipet çekin. Pipet ucu direnci M 2-4 (hedef hücre boyutuna bağlı olarak) bir Cl ile dolu olmalıdır – tabanlı bir çözüm. Standart elektrofizyolojik teknikler kullanılarak görüntülenmiştir nöron bir tam hücreli kayıt oluşturulması. Bir boşluk ücretsiz veri toplama protokolü kullanılarak spontan postsinaptik akımlar (sPSCs) kaydedin. 0,2-1 mcM tetrodotoxin ve / veya düşük Ca 2 + uygulayın ekstrasellüler çözüm içeren minyatür postsinaptik akımlar (mPSCs) kayıt için. Çözümler ve farmakolojik ajanları, hücrelere doğrudan uygulanabilir. Biz bir step motor tahrikli mikromanipülatör üzerine monte edilmiş boru yanal hareket içeren bir çözüm değişimi ile kare uçlu erimiş cam tüpler yerel superfusion kullanın. Bu alloekstrasellüler moleküler içeriği hızlı değişimler, reseptör agonistleri uygulaması, vb elde etmek için 100'ün üzerinde ms 10s çözüm alışverişi için Akaike ve arkadaşları tek presinaptik BOUTONS 3,4 uyarmak için teknikler geliştirdik. Mikropipet görüntülenmiştir bouton yakın yerleştirilir ve stimülasyon (5-10 uA olumsuz uyaran akımları, 0.1-0.2 ms süresi) verilir. Üniter IPSCs kaydedilir ve presinaptik ve postsinaptik fonksiyon değişiklikleri incelemek için bu tür hataları yöntemi gibi yöntemler kullanılabilir. 5. Görüntüleme Presinaptik Terminalleri Postsinaptik nöron yama pipet ile çeşitli boyalar ile dolu olabilir. Nöronlar da seçili hücre popülasyonlarında yeşil floresan proteininin (GFP) gibi floresan proteinleri (FP) ifade farelerden alınan yapılabilir. Belirli interneuron popülasyonlarda Çerçeve ifade farelerde yapılan vibrodissociated nöronların presinaptik terminaller üzerinde görselleştirilebilir olabilir. Örneğin, glutamat dekarboksilaz 65 (GAD65) hipokampal sepet hücreleri ve diğer internöronlar organizatörü gösterisi yeşil somata ve süreçler tarafından tahrik GFP ifade fareler. Hipokampal CA1 bölgeden Vibrodissociated piramidal nöronlar somata ve proksimal dendritler (Şekil 1A) apposed GFP pozitif akson terminalleri var. Ifade synaptopHlourin (pH hassas GFP mutant sinaptik vezikül ilişkili VAMP2 protein için erimiş) pH duyarlı floresans (Şekil 1B), FP-pozitif bağlı BOUTONS Thy1 promotör kontrolü altında olduğunu fareler vibrodissociated piramidal nöronlar. Presinaptik BOUTONS AM-esterleşmiş bileşikler 5 kullanılarak kalsiyum göstergesi boyalar ve diğer floresan moleküller yüklü olabilir. Şekil 2 kalsiyum göstergesi boya Fluo4-AM kullanarak yükleme bir örnek gösterir. İlk önce, 1-2 mcM esterleşmiş boya, 10 dakika süreyle 37 ° nöronlara uygulanır. Boya, ücretsiz, hücre geçirgenliği olmayan ve unquenched boya verimli tutunmaya esterazlar molekülün hücre içi ortamı, içine nüfuz edebilir. Bu yaklaşım, hem de pre-ve postsinaptik hücresel elemanları yükler. Yükleme sonrasında, hücrelerin Hepes-tamponlu salin solüsyonu ile yıkanır ve ek bir 10 dakika için 37 ° 'de tuttu. Cam bir pipet elektrot ile bir GΩ-mühür yapmak için, önce hücrelerin dış tampon çözelti ile 3 defa durulanır. A tam hücreli kayıt sonra boya içermeyen hücre içi bir çözüm ile kurulur. 2-5 dakika sonra kayıt boya çoğunlukla Fluo-4 yüklü sinaptik BOUTONS görselleştirme sağlayarak, postsinaptik nöron kaldırılır. Bu teknik, Ye ve ark 5 öncülük . Boya yüklü BOUTONS sonra, ya bir kamera tabanlı veya multiphoton mikroskop ile yüksek büyütme, yüksek sayısal açıklık amacı ile görüntülenebilir. Eşzamanlı tam hücreli kayıt ve kalsiyum görüntüleme Şekil 3'te gösterildiği gibi bir kurulum kullanarak elde edilebilir. Nöron ve Şekil 2C olarak gösterilen BOUTONS bir elektron çarparak şarj bağlı cihaz (EMCCD) kamera görüntüleri ele geçirildi. Uyarma için ışık kaynağının gücü% 12 çıkışı için ayarlanabilir bir nötr yoğunluk 1.0 filtre ve iris filtresi ile% 1.2 'ye zayıflatılmış oldu. Yeşil presinaptik BOUTONS Kalsiyum transientler gözlenen ve gerçek zamanlı olarak kaydedilen ve çevrimdışı ölçülür. 6. Temsilcisi Sonuçlar: Vibrodissociated Nöronlar spontan ve Akım Enjeksiyon Uyarılmış Ateşleme Tipik bir vibrodissociated hipokampal CA1 piramidal nöron Kayıtlar Şekil 4A gösterilmiştir. Spontan overshooting aksiyon potansiyelleri sıçan bazolateral amigdala, hipokampus ve VTA 1,5 ayrı piramidal nöronlar görülebilir. Yeterli büyüklükte depolarizan akımların güçlü akım enjeksiyon yanıt olarak ılımlı mevcut seviyeleri ve non-konaklayan aksiyon potansiyelleri ile tipik gecikmeli ateşleme paterni ile overshooting aksiyon potansiyelleri ortaya akım enjeksiyon hiperpolarizan CA1 piramidal nöronlar sırasında mevcut klemp kayıtları, (tipik voltaj tepkilere neden Şekil 4B). Vibrodissociated Nöronlar spontan ve Minyatür GABAerjik inhibitör postsinaptik Akımlar CSCL tabanlı bir hücre içi çözümü ile gerilim-klemp kayıtları sırasında, spontan sinaptik akımlar (Şekil 5A) görülmektedir. Bu olaylar, düşük kalsiyum içeren çözeltisi 2,6 elimine ve en nöronal türleri tamamen GABA A reseptör antagonistleri, bicuculline veya gabazine (Şekil 5B, C) ​​olarak, GABA serbest bırakılması ve aktivasyonu aracılı sIPSCs belirten tarafından engellenir bu inotropik reseptör alt tipi. Ancak, bazolateral amigdala 2 ve ventral tegmental alan 5,7, GABA A reseptör blokajı gibi beyin bölgeleri esas nöronlarAMPA-tipi reseptörlerin glutamatergik aktivasyonu aracılığı ile kısa süreli EPSCs ortaya koymaktadır. İlginçtir, en toksin hassas voltaj kapılı sodyum kanallarının blokajı için özel konsantrasyonlarda TTX uygulama, bazı beyin bölgelerinde (Şekil 6A) 2,4,7 vibrodissociated nöronlar gözlenen sIPSCs frekans ve genlik azaltır . Bu nedenle, sodyum kanal aktivitesini sıkışmak-off sinaptik BOUTONS GABA sürümde katılır. Bu terminallerde tam gelişmiş sodyum aksiyon potansiyelleri ortaya çıkarsa henüz belli değil. Bu iyi bir mühürlü 1 mcM çaplı akson terminaline giriş direnci GΩ aralığı içine iyi olması muhtemel olduğunu kaydetti değerdir. Bu nedenle, sodyum kanalları bile az sayıda açılması uyarma salgılanması kaplin arabuluculuk kalsiyum kanalları etkinleştirmek için terminalleri depolarize için yeterli olabilir. Bu kalsiyum kanalları konuda, kanıt, N ve P / Q-tip kanalları hipokampal CA1 ve başka bir yerde 8 vibrodissociated hazırlıklarında GABAerjik terminallerinde serbest katılmak olduğunu göstermektedir . Nörotransmitterler ve reseptörleri sayısına göre modülasyon ve iletim plastisite vibrodissociated nöronlar kullanarak 3,4,9 incelenmiştir. Gibi düzenleyici eylemler olduğu gösterilmiştir nörotransmitterlerin adenozin, GABA, serotonin, endokannabinoidlerin, vb 2,6,10,11,12. Buna ek olarak, endokannabinoid bağımlı inhibisyonu (DSİ) depolarizasyon indüklenen bastırma gibi kısa vadeli sinaptik plastisite, aynı zamanda bu hazırlık 2,11 açıklanan olmuştur . Bu bulgular, endojen nöromodülatör reseptör-aracılı ve trans-sinaptik sinyalizasyon birçok formları vibrodissociated hazırlık bozulmamış olduğunu göstermektedir. Vibrodissociated Hazırlık Kalsiyum Geçici ve Axon Terminalleri veziküler Yayın Yukarıda tarif EMCCD donanımlı inverted mikroskop kullanarak, vibrodissociated nöron bouton hazırlanmasında presinaptik terminaller kalsiyum transientler inceledik. Şekil 2 hipokampal CA1 piramidal nöron AM-esterleşmiş Fluo-4 ve sonraki postsinaptik boya seyreltme hücre yükleme gösterir. Spontan kalsiyum geçişlerini Şekil 6B ilgi alanları (ROI) olarak gösterilen bazı boya dolu BOUTONS görülmektedir. 1 mcM tetrodotoxin (TTX) Uygulama sonraki kalsiyum yükselir, kendiliğinden BOUTONS aktive voltaj kapılı sodyum akımlarının aktivasyonu ile aracılı olduğunu belirterek, bu kendiliğinden transientler ortadan kaldırır. Presinaptik terminalleri (Şekil 7A) karşılık ROI'ler ölçülen hızlı çözüm değişimi ile 40 mM, 10 mM ekstrasellüler KCl artırılması floresan artan üretir. Postsinaptik nöron aynı anda kayıt sIPSCs izlemek ve olay sıklığı yüksek-K + depolarizasyon (Şekil 7B) artış olup olmadığını belirlemek için kullanılır . SynaptopHlourin Thy1 organizatörü (spH21 fareler etiketli) kontrolü altında inşa ifade fareleri kullanılmıştır presinaptik BOUTONS vezikül füzyon görselleştirmek için. SynaptopHluorin bir moleküler yapı pHlourin (GFP gelişmiş pH duyarlılığı ile bir mutant) 12 Ekliptik vezikül ilişkili membran proteini (VAMP2) 13 ile bağlantılıdır. Bu düzenleme, nispeten daha asitli bir ortama floresan doyurur vezikül lümen pHlourin motifi situates. Vezikül füzyon üzerine, bu motifin veziküller / presinaptik terminaller uygun puncta floresan çıkan bir artış ile daha nötr ekstrasellüler ortama maruz kalmaktadır. SpH21 farelerden alınan hipokampal nöronların Vibrodissociation GABAerjik terminalleri (Şekil 8A) için beklenen boyutu ve konumu floresan puncta görünüm için izin verir. Uygulama yüksek K + – harici bir çözüm içeren bu terminallere floresan artar ve ekstrasellüler kalsiyum, 0.2 mM (Şekil 8B) azalır harici bir çözüm bulunması bu etkiyi bloke edilir . Böylece, floresan depolarizasyon kaynaklı artış, nöron bouton hazırlanmasında GABAerjik sinaps uyarma-sekresyon kaplin yansıtacak şekilde görünür. Presinaptik kalsiyum transientler ve nöron bouton hazırlık akson terminallerinde vezikül füzyon ölçmek için yetenek bize nöromodülatör istismar ve sinaptik plastisite uyarma-sekresyon kaplin ve ekzositoz / endositoz yer presinaptik mekanizmaları, ilaçların etkilerini incelemek için olanak sağlar. Bu teknikler aynı zamanda presinaptik işlevi ve modülasyon / plastisite, özellikle proteinlerin rolleri incelemek için, diğer moleküler araçlar ve genetik olarak fareler ile kombine edilebilir. Şekil 1 hipokampal CA1 bölgeden Vibrodissociated nöronlar DIC (A) Birleştirilmiş görüntüGAD65 fare nd yeşil floresan görüntüler. DIC görüntü (B) Floresan görüntü açıkça synaptophluorin (spH21) fare yeşil terminalleri yerleri göstermek için birleştirilir. Ölçeği bar = 10 mikron Şekil 2 Kalsiyum göstergesi yükleme prosedürü: (A) tam hücre AM-esterleşmiş boya ile yüklü; (B) tam hücreli kayıt boya sulandırır; (C) terminalleri ilgi alanları (ok başları) olarak görünür. Şekil 3 vibrodissociated nöronların presinaptik terminaller aynı anda tüm hücre kayıt ve kalsiyum görüntüleme için deney düzeneği şematik. EMCCD = elektron çarparak şarj cihazı birleştiğinde. Şekil 4 Temsilcisi dalga şekilleri gösteren (A) spontan eylem vibrodissociated CA1 nöron potansiyelleri ve (B) membran gerilimi yanıtları hiperpolarizan ve bir CA1 nöron akım kelepçe kayıtları güncel enjeksiyonları depolarizan. Şekil 5 (A) CA1 piramidal nöron kendiliğinden IPSCs Temsilcisi dalga şekilleri. Bicuculline (20 mcM C) (BC) IPSCs gabazine (B 10 mcM) ya da bloke edildi. Şekil 6 TTX spontan GABAerjik sinaptik iletim engeller ve vibrodissociated hipokampal hazırlık presinaptik kalsiyum geçişlerini ortadan kaldırır. (A) önce bir vibrodissociated nöron ve TTX uygulama sırasında Kayıt. Sıklığında azalma ve sIPSCs genlik unutmayın. (B) Kalsiyum transientler önce bir vibrodissociated nöron bir Fluo-4-yüklü presinaptik terminal ve TTX uygulama sırasında gözlenmektedir. Transientlerin tam kaybı unutmayın. Şekil 7 Eşzamanlı kalsiyum gösterge görüntüleme ve yüksek K + stimülasyon etkilerini gösteren sIPSC tam hücreli kayıt. (A) Floresans Fluo 04:00 boya ile yüklü bir presinaptik bouton zamanla ölçülür. (B), sIPSC frekans ve genlik yüksek K + uygulama sırasında aynı anda artar. Şekil 8 Ca 2 +-bağımlı yüksek K + yanıt hipokampal CA1 bölgeden spH21 piramidal nöron presinaptik BOUTONS. (A) vibrodissociated bir nöronun Floresan görüntü. (B) High-K + uygulama (siyah çubuk ile gösterilir) normal ekstrasellüler Ca 2 + içeren bir çözüm (2 mM Ca2 +) varlığı floresan sürekli bir artış ile sonuçlanmıştır . Düşük ekstrasellüler Ca 2 + (0.2 mM Ca 2 +) floresan artış gözlenmiştir. Grafik veri ön-yüksek-K + floresan seviyeleri normalize ve 3 BOUTONS ortalama tepki göstermek.